耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌的耐药基因检测及传播机制探讨

俞凤，胡龙华，蒋沁炆，钟桥石，陈艳慧，方雪瑶

(南昌大学第二附属医院/江西省医学检验重点实验室，南昌330006)

大肠埃希菌是临床最常见的条件致病菌，可引起血流、泌尿道、下呼吸道等多部位感染，在医院分离常见细菌分布构成中位列第一[1]。产β-内酰胺酶是大肠埃希菌对β-内酰胺类药物耐药的主要原因。抗菌谱广、抗菌活性强、组织渗透能力强和对β-内酰胺酶稳定性好的碳青霉烯类抗生素，是治疗此类细菌感染的首选用药，国内常用的碳青霉烯类抗生素有亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南、多尼培南等。随着近年来碳青霉烯类抗生素的广泛使用，产碳青霉烯酶菌株的检出率不断出现，以前主要为非发酵菌的鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌，近几年肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药性上升速度较快，已成为学者们关注的重点。中国细菌耐药监测网(CHINET)2008年监测数据显示，对碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美罗培南耐药的大肠埃希菌分别为0.2%和0.3%[1]，2015年则分别达到1.4%和1.6%[2]。耐碳青霉烯类大肠埃希菌感染的患者常困扰着临床医生，了解耐碳青霉烯类大肠埃希菌的耐药特点及耐药机制是临床的迫切需求。本研究对临床分离到的3株耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌及其接合子进行了耐药基因检测和测序，对其可能的传播机制进行了探讨。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株、仪器及试剂 南昌大学第二附属医院2016年1月～2017年3月临床分离的耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌共153株，其中3株为耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌(分别分离自骨科、胃肠外科、肿瘤科的3例患者的脓液)，依据本研究机构菌株库的收集码对其进行编码，分别为DC10、DC44、DC52(对常用16种抗生素的药敏试验结果显示，DC10、DC44、DC52对亚胺培南的最低抑菌浓度均≥16 μg/mL，对替加环素全部敏感，对头孢类及哌拉西林/他唑巴坦均不敏感，对喹诺酮类药物均耐药，对氨曲南均耐药)。阴性参考菌大肠埃希菌ATCC25922、感受态菌耐叠氮钠的大肠埃希菌J53为江西省医学检验重点实验室保存。Vitek2-compact全自动微生物分析仪、配套试剂以及药敏E-test条购自法国生物梅里埃公司，PCR仪购自杭州朗基科学仪器有限公司，电泳仪购自Biorad公司，凝胶成像仪购自上海天能公司。PCR试剂、DNA Marker购自北京天根生化科技有限公司，PCR引物由杭州擎科生物工程有限公司合成。

1.2 DC10、DC44、DC52的耐药基因检测及测序 煮沸法提取DC10、DC44、DC52的DNA，分别选择碳青霉烯类耐药基因(blaKPC、blaVIM、blaGES、blaIMP、blaNDM、blaGIM、blaOXA-23/48等)、β-内酰胺类耐药基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M)、喹诺酮类耐药基因(qnrA/B/S)引物进行扩增，所用引物及序列参照文献[3]。建立25 μL PCR反应体系：正、反向引物各1 μL，DNA聚合酶12.5 μL，三蒸水补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，根据各自引物的不同确定相应退火温度，72 ℃ 1 min，35个循环后，72 ℃延伸7 min。扩增产物在含Gold viewI染料的1%琼脂糖凝胶中150 v电泳20 min，用紫外凝胶成像系统观察并拍照记录。出现目的条带即为检测基因阳性，阳性产物送杭州擎科生物股份有限公司进行测序，结果经美国国立生物技术信息中心(NCBI)核酸序列比对，确定耐药基因型别。

1.3 DC10、DC44、DC52与J53的接合及接合子菌种鉴定、药敏试验、耐药基因检测 供体菌为DC10、DC44、DC52，受体菌为耐叠氮钠的大肠埃希菌J53，分别接种于血平板，35 ℃孵育过夜。挑取3～5个新鲜培养菌落接种至LB 培养基，37 ℃摇床4 h后，供体菌和受体菌分别以1:4比例混合至1 mL的LB培养基中，35 ℃孵育过夜。吸取过夜培养的混合菌悬液100 μL，接种于含美罗培南(2 μg/mL)和叠氮钠(150 μg/mL)的M-H培养基上，以供体菌和受体菌为质控菌，37 ℃孵育过夜，挑取M-H培养基上的单个菌落或菌膜，转种至血平板，35 ℃孵育过夜。按“1.2”方法对接合子进行菌种鉴定、药敏试验、耐药基因检测及测序。

1.4 DC10、DC44、DC52的多位点序列分型(MLST)和亲缘性分析 采用PCR方法对DC10、DC44、DC52的7个管家基因(adk,fumc,gyrB,icd,mdh,purA和recA)进行扩增、测序，所用引物及反应条件参照MLST网站(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)。测序结果经该网站比对，确定菌株序列型别。采用eBURST软件分析DC10、DC44、DC52的亲缘性。

2 结果

2.1 DC10、DC44、DC52的耐药基因及测序结果 DC10、DC44、DC52中blaNDM基因均阳性，其他碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因检测均阴性。经测序确认DC10、DC52均携带blaNDM-1基因，其中DC52同时携带blaTEM-1基因；DC44携带blaNDM-3基因，同时携带blaTEM-1基因和blaCTX-M-15基因。

2.2 DC10、DC44、DC52与J53的接合及接合子菌种、药敏试验、耐药基因 DC10、DC44、DC52均与J53接合成功，接合子为大肠埃希菌。接合子除对替加环素、阿米卡星敏感外，对β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素均耐药。耐药基因检测及测序结果显示，DC10、DC44、DC52与J53的接合子均含有与DC10、DC44、DC52相同的碳青霉烯类耐药基因。

2.3 DC10、DC44、DC52的MLST和亲缘性 DC10、DC44、DC52共分3个序列型(ST)，DC10为ST744、DC44为ST7219、DC52为ST167。eBURST软件分析结果显示，ST744和ST167同属于CC10克隆群，ST7219属于CC131克隆群。

3 讨论

本研究共收集到3株耐碳青霉烯类大肠埃希菌，均为多重耐药株，其药敏结果较为相似，均对替加环素和阿米卡星敏感，其中对头孢类、喹诺酮类及磺胺类抗生素表现出相同的抑菌浓度，对亚胺培南的最低抑菌浓度均达16 μg/mL。

新德里金属β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamse-1，NDM-1)是革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制，由blaNDM-1基因编码，也称blaNDM-1酶。blaNDM-1酶属于NDM-1，其活性部位为金属离子Zn2+，能水解除单环类外的其他β-内酰胺类抗生素。blaNDM-1酶的活性部位可被乙二胺四乙酸及巯基化合物等抑制，但不能被β-内酰胺酶抑制剂抑制。blaNDM-1基因多数位于质粒上，且携带这种基因的质粒有多种类型，如IncF、IncN和IncA/C等，这些质粒多数具有宽宿主特性，可在不同菌属间传播。本研究通过接合实验、PCR扩增耐药基因的检测发现，DC10、DC44、DC52均与J53接合成功，接合子均含有与DC10、DC44、DC52相同的碳青霉烯基因，证明了此耐药基因可以通过质粒水平传播。

自2008年首次检测到分离出blaNDM-1酶的肺炎克雷伯菌[4]，全球各地相继在大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌等不同菌属中分离出blaNDM-1酶[5]。blaNDM-1酶不能水解单环β-内酰胺类抗生素如氨曲南，但由于质粒上往往同时携带其他多种耐药基因，如blaCTX-M、blaTEM和qnr等，常常会导致多重耐药菌甚至泛耐药菌的出现。本研究中3株耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌对氨曲南均耐药，这与文献报道有超过 80%的blaNDM-1阳性菌株对氨曲南同时耐药一致[6]。

MLST结果显示3株耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌分属于3种不同的ST型，eBURST软件分析DC10(ST744)与DC52(ST167)同属于CC10克隆群，其祖先均为ST10，表明此两株实验菌存在相同起源性。DC44(ST7219)属于CC131克隆群，其祖先为ST131。文献报道[7]显示，ST131在全世界范围内流行，并且发现CTX-M-15的O25b-ST131克隆菌株多数属于种系发育B2群，为高毒力克隆群，而本实验中携带blaNDM-3的DC44菌株为ST7219型，与ST131相比，仅管家基因icd发生了改变，这可能与文献报道的高毒力机制有关。

目前blaNDM突变体已有17 种，2008年在瑞典首次报道产blaNDM-1酶的肺炎克雷伯菌[4]，2011年在英国发现产blaNDM-5酶的大肠埃希菌[8]，2014年在印度发现产blaNDM-4酶的大肠埃希菌[9]，2016年在中国发现产blaNDM-9酶的大肠埃希菌[10]，其余blaNDM亚型在全球各地也相继报道[11]。blaNDM-3是blaNDM-1的变异体，在283位点发生T-C核苷酸突变，使其翻译的氨基酸由天冬氨酸转变为天冬酰胺，我们分析可能是由于两种氨基酸的特性接近，二者有较相似的酶活性[12]。有关blaNDM-3的报道较少，最早于日本1名患者的粪便中分离到1株大肠埃希菌中发现[13]。本研究报道的产blaNDM-3酶的大肠埃希菌在中国属首例。

综上所述，耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌的耐药基因为blaNDM基因，blaNDM能通过质粒水平传播。本研究发现1株产blaNDM-3酶的大肠埃希菌，目前国内尚未见报道，我们首次在中国检出1株产blaNDM-3酶的大肠埃希菌，并且该菌株同时携带blaTEM-1和blaCTX-M-15基因，耐药现象严重，需高度关注。