miRNA在疾病诊断和治疗中的研究进展*

于水澜，宋 琳，张淑香

1.黑龙江中医药大学 基础医学院(哈尔滨150040)

1 miRNA的来源

miRNA是一组小的非编码RNA(ncRNA)分子，通过调节靶mRNA转录或转录后翻译，诱导靶基因表达沉默而发挥广泛生物学作用[1]。1993年，科学研究人员通过正向遗传学发现第一个来自秀丽线虫中的miRNA，鉴定了发育调控因子lin-4[2-3]。第二个线虫miRNA let-7直到7年后才被识别[2]。Ruvkun和Ambros实验室认为，miRNA是一种常规的蛋白质编码基因。他们做了令人吃惊的发现，即lin-4不编码蛋白质，而是编码22个核苷酸的调控RNA[4-5]。他们证明lin-4 RNA可与线虫发育网中的另一个基因lin-14的mRNA进行碱基配对，并控制lin-14蛋白的产生[5]。然而，迄今为止，人类发现了1 900多个miRNA[3]，其中许多已与人类常见疾病有关。通过高通量基因组学、生物信息学与传统分子生物学技术和动物模型相结合，miRNA的相关研究从实验室向临床转变，为人类健康带来极大的益处。国内外研究文献多是miRNA对于某一种或某一类疾病的研究或综合阐述，而在miRNA对于多种疾病的阐述方面相对较少。因此，本文主要选择了近年来死亡率较高的几种疾病，从其诊断和治疗的角度对miRNA的相关研究进展进行综述。

2 miRNA在疾病诊断和治疗中的研究进展

2.1 癌症

2.1.1 肝癌 Tao等[6]以c-Myc和AKT / Ras诱导的肝肿瘤为模型，确定了选定的miRNA在体内的肿瘤抑制活性。该研究团队使用qRT-PCR证明了8个miRNA的表达：miR-101、miR-107、miR-122、miR-29、miR-365、miR-375、miR-378和miR-802，且在c-Myc和AKT / Ras肝肿瘤模型中下调，其中4个miRNA(miR-101、miR-29、miR-107和miR-122)的表达与患者相关性显著，而在非肿瘤肝组织中则不表达。Cartier等[7]利用功能筛选系统，确定了10种新miRNA，其在恶性肝细胞中控制磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)表达，其中miR-4510、miR-203a-3p、miR-548aa、miR-376b-3p和miR-548v降低GPC3的表达水平。与非肿瘤性肝脏相比，这5种miRNA在肿瘤中显著下调，并抑制肿瘤细胞增殖。其中，miR-4510上调了几个肿瘤抑制基因的表达，同时降低了其他促癌基因的表达，为miR-4510的肿瘤抑制活性提供了强大的分子、细胞和体内证据，从而使这种miRNA在肝细胞癌治疗中的潜在价值受到关注。

2.1.2 肺癌 Cazzoli等[8]通过独立的较大样本组评估选定的miRNA。选择4种miRNA(miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p)进行筛选测试，将人群分为两组：结节(肺腺癌+癌)和非结节(健康的前吸烟者)。在“结节”组中选择6种miRNA(miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p)进行第2次测试以区分肺腺癌和肉芽肿。实验结果显示，“筛查试验”显示敏感性为97.5%，特异性为72.0%，AUC ROC为90.8%；“诊断试验”敏感性为96.0%，特异性为60.0%，AUC ROC为76.0%。这一研究证明了miRNA作为肺癌筛查试验和诊断试验生物标志物的潜能。Takamizawa[10]及其同事提供了首次证实miRNA表达异常与肺癌预后相关的证据。与正常肺组织中的表达水平相比，许多患者肺癌细胞系中let-7的表达显著降低，且let-7低表达的患者总体生存率低于let-7高表达患者。除let-7外，还有一些其他的miRNA被认为对肺癌的预后有意义。Yanaihara等[9]分析了104对肺癌和相应的非癌性肺组织中的miRNA表达，并鉴定出表达程度在统计学上显著差异的miRNA。肺腺癌中的miRNA表达模式与鳞状细胞癌相比有显著差异。肺腺癌患者高表达hsa-mir-155或降低hsa-let-7a-2表达与预后不良相关。然而在多变量分析中，只有高hsa-mir-155表达仍具有预后意义，以上研究均可说明miRNA有助于肺癌的诊断和预后。

2.1.3 膀胱癌 miRNA标记的评估提供了区分肌肉浸润性膀胱癌，非肌层浸润性膀胱癌和非癌性对照的方法，使用微阵列技术研究了20例膀胱癌组和18例对照组。由于参与人数较少，该研究仅能提供了初步的数据，表明这种方法对于早期发现膀胱癌的实用性[10-11]。Ratert等[12]利用微阵列技术，然后使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)的验证步骤进行筛选研究，检测了15个特定的miRNA，其中7个(miR-125b、miR-130a、miR-139-5p、miR-145、miR-199a-3p、miR-214和miR-222)上调，相对于健康组织，8个miRNA在肿瘤组织中下调。此外，发现miR-20a、miR-106b、miR-141和miR-205在膀胱癌中上调[13]，与其他位置如肾或前列腺癌中的表达行为相反[14]。

2.2 心血管疾病

2.2.1 心肌梗死(MI) Liu等[15]使用微阵列比较了在MI模型大鼠中使用或不使用骨骼肌(SkM)细胞疗法的miRNA和mRNA的表达谱，探讨SkM对缺血大鼠的心脏保护作用，并通过定量实时PCR法证实了miRNA表达与潜在靶基因mRNA水平的一致性。数据显示，与未处理的MI后相比，MI组中有160种miRNA差异性表达，在SkM组中有78种miRNA差异性表达。Liu等[15]重点研究了5种凋亡相关的miRNA(miR-30a-5p、miR-30c-5p、miR-145-5p、miR-143-3p和miR-140-3p)和7种抗凋亡靶基因。同时，也为进一步研究SkM移植背景下差异表达的miRNA的功能特性和针对MI的miRNA干细胞疗法的开发提供了极好的起点，并且证明靶基因可能成为心脏恢复后的新的治疗靶标MI。Cheng等[16]评估了miRNA与心肌梗塞之间关联性，且使用测试灵敏度和特异性的估计来评估诊断性能。结果显示，总miRNA：敏感性为0.78，特异性为0.82；miR-499：灵敏度为0.88，特异性为0.87；miR-1：灵敏度为0.63，特异性为0.76；miR-133a：灵敏度为0.89，特异性为0.87；miR-208b：灵敏度为0.78，特异性为0.88。miRNA与其他心肌梗死诊断标志物之间的相关性明显。说明miRNA，特别是miR-499和miR-133a可能适合用作心肌梗死的诊断标志物。

2.2.2 动脉粥样硬化 Hartmann等[17]调查内皮Dicer单核细胞黏附和动脉粥样硬化的作用。MiR-103在Dicer缺陷的EC中下调，并通过靶向KLF4促进CXCL1介导的单核细胞黏附。总的来说，Dicer可通过增加miR-103表达来增强动脉粥样硬化和内皮炎症。Dicer缺乏ApoE小鼠内皮细胞通过下调CXCL1减少单核细胞与早期动脉粥样硬化内皮的黏附，从而减少病变的形成。因此，动脉粥样硬化的动脉位点上的酶活性可能通过产生促炎性的miRNA而发挥致动脉粥样硬化的作用，这也使得miRNA成为潜在的动脉粥样硬化诊断标志物。

2.2.3 冠心病(CHD) Huan等[18]研究了186例CHD病例和186例对照的全血miRNA和mRNA表达与遗传变异进行整合，系统地描述了冠心病的复杂基因组结构。在FDR< 0.2时，15种miRNA在CHD病例和对照之间差异表达。发现CHD病例和对照组之间miRNA-mRNA相关性存在很大差异。此外，3种miRNA(miR-1275、miR-365a-3p和miR-150-5p)与CHD因果关联的mRNA共表达模块相关，且反映了B细胞中心免疫功能的失调。研究结果证实，miRNA是通过遗传控制和与mRNA紧密共表达而参与CHD的生物过程的重要调节剂，有利于CHD的诊断和治疗。

2.2.4 高血压 一些研究已强调了miRNA参与血压调节，特别是影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统。Marques等[19]比较了未经治疗的高血压和血压正常的个体肾组织中miRNA和mRNA的表达。使用微阵列技术，筛选了850个miRNA，并鉴定了9个表达差异的miRNA，其中两个miRNA(miR-181a和miR-663)与人肾中抑制肾素表达相关。此外，miR-132和miR-212在接受10 d的血管紧张素-Ⅱ注射大鼠的心脏，二者在主动脉和肾脏中上调，并且下调1型血管紧张素-Ⅱ受体阻滞剂治疗患者的动脉，提示miR-132和miR-212在血管紧张素Ⅱ介导的高血压中的作用。有研究[20]还发现，miR-145在高血压患者和血压正常的颈动脉内膜切除术患者的动脉粥样硬化斑块中过度表达，暗示miR-145是血压介导的血管损伤的潜在关键调节因子。

2.3 其他疾病

2.3.1 肝炎 Winther等[21]通过随访一组42例CHB患儿，抽出180个血液样本，先前鉴定的16种miRNA的血浆水平通过定量实时聚合酶链式反应进行分析，使用ARCHITECT HbsAg测定法定量血浆HBsAg。结果发现，CHB患儿中存在14 ～ 16个血浆miRNA，且在疾病的不同免疫阶段显著差异表达，只有miR-122被证明可抑制HBV的复制。然而，需要进一步的研究来提高对microRNA和RNA的理解，以及HBsAg在儿童慢性乙型肝炎发病中的作用。Motawi1等[22]调查了7种选择的干扰素相关微RNA(miR-146a、miR-34a、miR-130a、miR-19a、miR-192、miR-195和miR-296)，选择106名CHC患者和40名匹配的健康对照。与对照相比，血清miR-34a、miR-130a、miR-19a、miR-192、miR-195和miR-296上调，而血清miR-146a下调。其中，miR-34a、miR-195和miR-192可预测治疗反应。分析结果可用作CHC治疗个体化的新型非侵入性诊断和预后药物遗传学生物标志物，并可帮助鉴定基于miRNA的新的抗病毒药物。

2.3.2 免疫性疾病 据报道，miR-21，mi-148a，mi-126和mi-29b[23-24]等几种miRNA的过度表达通过靶向DNMT1影响狼疮CD4+T细胞的DNA甲基化机制。miR-21通过靶向Ras脒基核苷酸释放蛋白1(RASGRP1)基因间接改变DNMT1的表达，该基因中和DNMT1上游的Ras-MAPK通路。然而，miR-148a和miR-126通过与3'-UTR的相互作用直接抑制DNMT1的翻译。狼疮CD4+T细胞中miR-29b[24]和miR-126的异常过度表达导致甲基化敏感基因CD11a和CD70的低甲基化和过度表达，导致T细胞和B细胞活动过度。狼疮患者CD4+T细胞中这种miRNA表达的抑制引起逆转作用。因此，miRNA特有的行为可能被用作炎症性疾病侵袭性表型的预后生物标志物。

2.3.3 酒精性肝病和非酒精性肝病 酒精滥用会损害肝脏器官，但miRNA失调被认为在酒精性肝病中起关键作用。酒精性肝病(ALD)小鼠模型中miR-320、miR-486、miR-705和miR-1224的组织表达增加，且miR-27b、miR-214、miR-199a-3p、miR-182、miR-183、miR-200a和miR-322的表达水平降低[25]。大鼠模型显示，饮酒后外泌体中miR-122和miR-155的血清水平升高[26]。然而，由于酒精的全身作用，循环的miRNA生物标志物可能并非完全来源于肝脏[27]。Chen等[28]发现大鼠32个血清miRNAs上调或下调，但肝脏和血清之间的表达水平仅与miR-185、miR-199a-3p、miR-214和miR-490相关。在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)肥胖小鼠模型中，miR-122、miR-34a、miR-31、miR-103、miR-107、miR-194、miR-334-5p、miR-221和miR-200a上调，miR-29c、miR-451和miR-21在ob / ob小鼠中下调[25]。miR-146，miR-152和miR-200在高脂饮食大鼠中上调[29]。

3 展望

癌症和心血管疾病是世界范围内发病率和病死率较高的疾病。根据世界卫生组织的数据，估计每年有1 750万人死于心血管疾病，绝大多数死于中风和冠状动脉疾病(CAD)，占全球死亡人数的31%[30]；2012年约有1 400万癌症新病例和820万癌症死亡人数，这一数字在未来20年预计将上升约70%[31]，这严重影响了患者的生活质量。因此，建立一种可以诊断或治疗癌症、心血管及其他疾病的检测指标是非常必要的，而miRNA近来已成为调节基因表达的中心参与者之一，许多科学研究已揭示了miRNA在常见人类疾病中的作用，miRNA生物标志物和miRNA药物的同时发展已经在改善公众健康方面迈出了一大步。

生物标志物鉴定的最终目标是开发更好的临床检测方法，改善疾病的诊断或预后。实际上，miRNA已经被认为是下一代生物标志物的首选候选者，因为它们比其他候选物如蛋白质和代谢物具有一些优势。首先，miRNA生物标志物由于它们在调节级联中的上游位置而更可能导致早期诊断。其次，通过基因组工具如寡核苷酸微阵列和深度测序更容易发现新的miRNA生物标志物，其比蛋白质和代谢物生物标志物鉴定的主要工具——质谱法提供更高的通量。再次，扩增低丰度miRNA生物标志物，然后通过实时定量PCR(qPCR)在临床设置中检测。qPCR已经在FDA批准的临床试验中使用;而检测低丰度蛋白质或代谢物则没有等效的方法[3]。

综上所述，在广泛的人类疾病中已经鉴定出miRNA的异常表达谱，显示了miRNA作为具有高度特异性和敏感性的癌症新型诊断和预后生物标志物的巨大潜力。今后癌症和心血管疾病的治疗有望得到改善。