沙棘黄酮检测方法概述

陈 春

(1.山西省林业科学研究院，山西 太原 030012;2.国家林业局沙棘工程技术研究中心，山西 太原 030012)

沙棘为药食两用植物，一直以来都作为传统药物被用来治疗疾病，收录于《中国药典》。沙棘含有多种化合物，包括黄酮类化合物、类胡萝卜素、甾醇类、生育酚、脂类，还含有抗坏血酸、单宁等物质[1]，具有抗菌消炎、扩张冠状动脉、治疗高血压和脑溢血、抗癌等作用。沙棘黄酮主要包括异鼠李素、槲皮素、山奈酚、杨梅素等黄酮苷元及其苷类物质[2]。现在，可从沙棘中分离出的黄酮类化合物达32种[3]，且含量较高。例如，中国沙棘果实每100 g含有黄酮885.4 mg；西藏沙棘果实的黄酮含量更高，每100 g含1 104.7 mg 黄酮。

沙棘黄酮含量作为评价沙棘品质的常见指标，其主要检测方法包括：光谱分析法、色谱分析法、电化学分析法、化学发光法等。笔者对各检测方法进行了综述，旨在为今后沙棘黄酮的研究、开发及应用提供一定的参考。

1 光谱分析方法

1.1 紫外分光光度法

黄酮类化合物在紫外光图谱上主要有2个吸收带，环肉桂酰类物质在300 nm～550 nm产生的吸收带以及环苯酰类物质在240 nm～280 nm产生的吸收带[4]。通过对光谱区的吸光度值进行测定，根据溶液浓度和吸光度标准曲线进行计算可得到目标检测物质的浓度值。利用紫外分光光度法检测沙棘黄酮含量具有简便、准确度高、重现性好且检测技术易于掌握、仪器设备简单的优点[5]。紫外分光光度法检测沙棘黄酮，具体又分为以下3种方法：亚硝酸钠-氯化铝-氢氧化钠法、硝酸铝-醋酸钾法和三氯化铝法。

1.1.1 亚硝酸钠-氯化铝-氢氧化钠法

亚硝酸钠-氯化铝-氢氧化钠法是沙棘黄酮检测较为常见的方法之一，在氢氧化钠提供的碱性环境条件下，金属铝离子与沙棘黄酮类物质反应生成红色络合物[6,7]。在对沙棘不同部位的黄酮进行检测时，虽然对照品都是芦丁，但最大吸收波长和使用的乙醇溶剂浓度不同。沙棘叶、果部位吸收波长为510 nm，而果渣为500 nm；沙棘叶使用乙醇溶剂的浓度为70%，沙棘果为35%乙醇，沙棘果渣为30%乙醇[8]。因此，在用亚硝酸钠-氯化铝-氢氧化钠法检测沙棘黄酮时，要严格控制溶剂的浓度、试剂的添加时间、显色时间等，尽可能减少操作误差。

1.1.2 硝酸铝-醋酸钾法

硝酸铝-醋酸钾法检测沙棘黄酮含量，是依据铝离子同黄酮类化合物中的3位羟基、4位羰基或5位羟基、4位羰基或邻二酚羟基发生反应，生成络合物，使得吸收峰红移，从而测定出黄酮的含量[9]。

1.1.3 三氯化铝法

三氯化铝法的原理是在酸性条件下，沙棘黄酮醇母核中的5位羟基、4位羰基与金属铝离子络合产生物对400 nm波长有最大吸收[10]。利用三氯化铝法对沙棘黄酮进行测定时，应根据黄酮含量的不同选择不同的对照标准品，包括芦丁、槲皮素和异鼠李素，并且使用不同浓度的乙醇溶解[11]。

1.2 荧光分光光度法

荧光分光光度法(flourescence)的原理是：紫外线照射在由黄酮类物质与特定的金属离子络合产生的络合物上时会产生荧光，在一定的条件下，荧光的强度与络合物的浓度呈正相关，由此可以得到待测物质中黄酮类物质的总含量。虽然荧光光度法灵敏度高，准确性、重现性较好，同时具有操作简便的优点，在科研和生产实践中应用于植物黄酮的检测报道较多[12,13]，但是应用于沙棘黄酮检测的报道较少[14]，有待进一步深入研究。

2 色谱分析方法

2.1 高效液相色谱法

黄酮类物质均具有不易挥发、热不稳定、分子离子峰稳定，游离的苷元难溶或不溶于水、易溶于有机溶剂，黄酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂[15]的特点。因为黄酮苷具有极性强、难气化、不稳定的特点，所以高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是重要的沙棘黄酮检测方法。高效液相色谱法采用高压液泵、高效固定相、液体流动相、高压输出进行检测分析，具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高的优点，同时还可以得到沙棘待测样品中各个黄酮组分的具体含量数值[16]。但也存在检测设备昂贵、消耗流动相较多、检测成本高的缺点。当前使用较多的是反相高效液相色谱[17，18]，分离柱为C8柱和C18柱，以甲醛-水、乙腈-水为流动相。流动相的选择会直接影响出峰时间、分离度，可以通过调节 pH 值来改善色谱图的峰型。

2.2 薄层色谱法

薄层色谱法(TLCS)是将色谱技术和光密度计、电子计算机相结合的一种仪器分析方法。一定波长的光照射在薄层上，对薄层色谱中有紫外或可见光吸收的斑点，或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描到的图谱及积分值换算为药品的质量。薄层色谱法具有多通道效应，可以同时平行分离分析多个待测的沙棘样品；流动相色谱使用量也较高效液相色谱少，且更换方便；对样品的预处理要求也不高[19-21]。薄层色谱法是中药制剂检验中较为常用的分析方法，在《中国药典》中有33个中成药品种采用该法进行含量测定。在沙棘黄酮检测中也有使用，方法简便、特异性强、重现性好,可作为沙棘黄酮检测的优选方法之一。

2.3 超临界流体色谱法

超临界流体色谱法(Super Fluid Chromatography，SFC)是20世纪80年代发展起来的一种新型色谱技术。它具有气相和液相色谱所没有的优点,能分离、分析气相和液相色谱不能解决的一些对象,应用广泛,发展迅速。在使用超临界流体色谱法检测黄酮时，利用超临界流体或添加了改性剂的超临界流体做流动相，使黄酮单体分离后测定。目前该方法主要用于银杏叶黄酮的检测[22,23]，对沙棘总黄酮含量检测应用的相对较少[24]。

3 毛细管电泳电化学法

毛细管电泳(Capillary electrophoresis, CE)又称高效毛细管电泳(Highperfor-mance capillary electrophoresis, HPCE),是一种应用非常广泛的分离分析技术，现已被广泛应用于生物、医药等领域的样品分离检测[25]。毛细管电泳具有高灵敏度、高分辨率、高速度，分离检测用时少、样品和流动相用量少、成本低的优点[26]。毛细管电泳电化学法是近年来发展迅速的分析检测方法之一，也被应用在沙棘黄酮的检测分析中[27]，但有待进一步发展。

4 流动注射化学发光法

流动注射分析(Flow Injection Analysis, FIA)是在非平衡热力学条件下,在液流中重现地处理试样或试剂区带的定量流动分析技术。化学发光(Chemiluminescence, CL)是根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应中各组分的含量。将流动注射分析与化学发光结合形成的流动注射化学发光法(CL-FIA),是痕量分析法,具有分析速度快、线性范围宽、精度和灵敏度较高、成本低和易于实现自动化等优点[28],主要应用于药物、食品、环境检测以及元素分析等领域[29]。早在20世纪90年代初，已被应用于沙棘的检测了[30]，但没有得到推广。

5 结论

对以上4类方法进行比较，可以看出，各种方法在实际使用过程中各有利弊。紫外分光光度法是广泛使用的方法，其优点是简便、重复性好、易于学习掌握，使用的检测仪器较为便宜，但也存在易受杂质干扰、稳定性差的缺点。光谱分析法中的高效液相色谱法不仅具有抗干扰、重现性稳定、分离效能高、分析速度快的优点，而且可以精确的检测沙棘总黄酮中各个具体成分的含量，是目前沙棘总黄酮检测的主流趋势。其它检测方法在沙棘总黄酮检测中应用较少，一方面是受使用仪器设备所限，不利于推广普及；另一方面是应用于沙棘总黄酮检测时，方法还不够成熟稳定，有待进一步探索研究。

随着人们对沙棘黄酮作用的深刻认识，黄酮提取技术的不断提高，以及仪器分析技术的日益进步，沙棘黄酮的检验检测技术将来一定会更方便快捷、准确可靠。