miRNAs对肝星状细胞生物学功能调控机制的研究进展

梅怡晗，陈星，陈芳，喻雪琴，戢敏，梅小平

(1首都医科大学，北京1000069;2川北医学院附属医院)

肝纤维化(HF)是各种病因所致的慢性肝细胞损伤后持续发展的共同病理特征，是肝组织反复创伤与修复的炎性反应以及肝组织细胞外基质过度沉积的结果，是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段[1]。肝组织受损后, 在由各种炎性介质诱导的多信号转导通路介导下, 处于静息状态的肝星状细胞(HSC)被激活、增殖, 致肝细胞间基质(ECM)大量沉积，是导致肝纤维化、肝硬化发生的中心环节之一。目前临床上尚缺乏有效逆转或阻止HF进展的治疗药物。HSC是肝细胞外基质的主要来源，是正常肝组织和纤维化肝组织ECM的主要来源。肝组织受损后, 在由各种炎性介质诱导的多信号转导通路介导下, 处于静息状态的HSC被激活、增殖, 由静止型HSC转化为活化型HSC，分泌ECM在肝组织内大量沉积，是导致肝纤维化、肝硬化发生、发展的关键环节之一[2]。深入研究HSC的生物学行为、细胞外调控机制、信号转导通路、基因组学及免疫学调控等不同调控机制，有助于HF的诊断与治疗，以抑制HSC激活、增殖及促进HSC凋亡为靶点的治疗HF的研究方法已成为目前的研究热点。微小RNA( miRNA)是一种由19～22个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA，可与靶miRNAs全部或部分靶向结合后诱导miRNAs降解或转录抑制，对转录后的基因进行调控[3～6]。部分miRNAs在肝组织内表达，在肝脏疾病的发生、发展、预后和转归中发挥重要作用[7]。研究[8]发现，miRNAs可通过调控HSC生物活性功能来发挥对HF发生、发展的调控作用。存在于体内的miRNA能在转录与抑制基因表达方面起到重要的调控作用，特别是对HSC的激活、增殖或凋亡的特异性调控对肝组织纤维化的发生起到了重要的调节作用，为此可能对肝纤维化的分子靶向治疗提供新路径与理论依据。现将miRNAs在HSC生物学活性调控中的作用机制综述如下，旨在为HF的治疗提供新路径。

1 miRNAs在HSC激活中的作用机制

HSC是一种窦周细胞，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的间隙，即Disse内，胞体呈星状分布的长突，包绕肝细胞与肝血窦[9]。正常肝组织中HSC主要以富含VitA脂滴的静止型细胞存在，其增殖活性与胶原纤维合成能力均较低。其生理功能包括：ECM的合成与降解；细胞因子及受体的表达；肝窦血流量的调节等[10]。

HSC的激活是指在各种致炎因子作用下，将静息的、富含维生素A的细胞活化为致纤维化的肌成纤维化细胞，诱发并获得收缩纤维以及细胞增殖[11]。活化的HSC大量增殖后导致以胶原纤维为主的ECM分泌增多，并高表达具有收缩功能的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平，α-SMA的表达是HSC激活与活化的标志。HSC的活化包括HSC的活化启动与持续两个阶段。启动阶段是指基因表达与表型改变，使靶细胞对刺激因子发生反应的过程。持续阶段是这些刺激所产生的反应不断维持活化表型与促进纤维化的效应[12]。慢性肝病或肝组织纤维化过程中静止型HSC可转化为活化型HSC。活化型HSC参与并调节维生素A的代谢，为肝细胞储存能量；诱导机体产生基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶抑制物(TIMP)，参与肝组织ECM生成、降解或胶原纤维产生[13]，导致肝纤维化的形成。

HSC的激活与否是肝组织发生纤维化的中心环节。Chen等[14]研究发现，目前有17个miRNAs在高表达时可促进HSC的激活，同时有14个miRNAs在低表达时可促进HSC的激活。Venugopal 等[15]研究结果显示，miR-150、miR-194在激活的HSC 中低表达，表明miR-150、miR-194可抑制转录调节因子c-myb和rac-1表达，抑制HSC的激活，进一步降低ECM 的表达。Li 等[16]研究结果显示，HF模型大鼠活化型HSC中miR-34a/c高表达，而低表达的miR-34a /c能使活化型HSC转化为静息型HSC，miR-34a /c可能与抑制其靶基因过氧化物酶体增殖物激活受体α相关。

我们前期研究发现，大鼠肝纤维化模型活化HSC中miR-122、miRNA -150均呈低表达，这可能与miR-122、miRNA -150可抑制c-myb和rac1表达，进而抑制HSC活化；本研究同时发现，活化HSC中存在miR-221 、miR-222高表达，其高表达可能调控了HSC 激活的相关基因表达，诱导了HF的发生。促进miR-122和miRNA -150表达或抑制miR-221 、miR-222表达可抑制肝组织纤维化的发生发展。在体外细胞培养中发现，miR-221 、miR-222能促进HSC中Ⅰ型胶原的表达，进一步猜测miR-222可能激活NF-κB信号通路，来调控炎症反应。

TGF-β/Smad、p38MAPK、Wnt/β-catenin和P13K/Akt 等是调控肝组织纤维化发生发展的主要信号通路。其中TGF-β是参与HSC激活、增殖与凋亡作用的最主要的细胞因子之一，是调控肝组织纤维化发生的最主要的信号通路。TGF-β/Smad可抑制HSC的增殖与活化，导致ECM在肝细胞间的过度沉积而发生肝纤维化。HSC中miR-200高表达时可抑制其靶基因Keap1的表达，促进Nrf2的核迁移与激活，抑制TGF-β/Smad信号通路的激活，进而阻断肝纤维化的发生[17]；miR-200a高表达可抑制TGF-β对HSC的活化、增殖，降低Smad4的表达；抑制HF。Li等[16]研究发现，miR-33a对 PI3K/Akt 信号通路的活化具有调控作用，调控miR-33a的表达水平对PI3K/Akt 信号通路具有明显的调节作用。miR-214对PI3K/Akt信号通路具有明显的负性调节作用，进而诱导、促进了肝纤维化的发生。Sun等[18]研究发现，Wnt /β-catenin信号通路是miR-200a的下游靶基因和信号通路，miR-200a可通过调控Wnt/β-catenin信号通路来对肝纤维化发生的抑制作用，延缓或阻止肝纤维化进程。

转化生长因子β1(TGF-β1)是激活HSC的最强细胞因子，它可通过调控TGF-β1/Smad信号通路来激活HSC。研究[19]发现，miR-19b可通过靶向调控TGF-β1RⅡ/Smad3 的表达水平来降低Ⅰ、Ⅱ等前胶原的表达，进而调控肝组织纤维化的发生与发展。miRNAs通过调控细胞外调节蛋白激酶/细胞外信号调节激酶-1(Raf/ERK1)、肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)、Janus激酶/信号转导与转录激活因子(JAK/STAT)、第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白/肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶(PTEN/PI3K/AKT)等信号转导通路，促进HSC的激活。Wang等[20]研究发现，miR-29b通过与PI3KR1/AKT3的3′-UTR的结合来发挥抑制HSC的激活。Wei等[21]研究发现，miR-21高表达可激活HSC，miR-21m低表达可通过降低PTEN蛋白表达水平来抑制HSC的激活。对PI3K具有抑制作用的LY294002可抑制AKT信号通路的活化，抑制HSC的活化，进而抑制肝组织纤维化的发生。Zhang等[22]研究发现，miR-21可通过对SPRY2和HNF4α的3，-UTR的直接靶向作用来发挥负性调节作用，导致EKI1信号通路的激活，进而诱导HSC的激活来促进肝组织纤维化的发生、发展。

2 miRNAs在HSC增殖中的作用机制

有学者[23]研究发现，miR-19b、miR-150、miR-194、miR-146a、miR-29等可抑制HSC的增殖, 特别是miR-200a的失衡与肝组织纤维化中ECM的异常表达密切相关。Sun等[18]研究发现，用CCl4诱导大鼠发生肝组织纤维化，大鼠肝组织miR-200a呈低表达；HSC的增殖率明显升高，上调miR-200a的表达可降低TGF-β2的表达, 抑制TGF-β和Wnt/β-catenin信号通路的激活, 抑制HSC的增殖，发挥抗纤维化的作用；miR-200a可通过靶向调控胞质蛋白伴侣分子/核因子E2相关因子(Keap1 /Nrf2)信号通路来抑制HSC增殖。He等[24]研究发现，转化生长因子-1(TGF-1)诱导的HSC活化、增殖过程中存在miR-146表达降低；转染miR-146至激活的HSC中会抑制HSC的增殖。Sekiya 等[25]研究发现，在原代培养大鼠HSC的增殖过程中存在miR-195低表达，进一步分析认为miR-195能延迟HSC的G1期向S期发育来抑制HSC的增殖。miR-17-5p 可通过靶向调控Smad7来促进HSC的增殖而诱导肝组织纤维化的发生、发展[26]。

TGF-β1及相关膜受体结合并活化后，可招募、活化相同受体的下游Smad家族蛋白，miRNAs可通过对TGF-β1/Smad信号通路的调控，促进HSC增殖。在大鼠肝HSC自发活化过程中，HF组织中miR-9表达升高，且其表达水平与肝组织纤维化程度呈正相关，HF组织中miR-150表达降低，提示miR-150可抑制HSC的增殖。

研究[27～29]发现，在TGF-β1诱导活化的HSC中miR-17表达升高，靶向调控Smad7表达，进而诱导、促进HSC增殖。相反，TGF-β1诱导活化的HSC中miR-146表达降低，抑制miR-146表后活化型HSC数量减少，HSC的增殖能力与数量下降，α-SMA表达降低，表明miR-146、miR-17表达变化可通过影响Smad7表达调控HSC的增殖。

3 miRNAs在HSC凋亡中的作用机制

促进HF的发生与逆转的关键在于促进HSC凋亡，HSC大量凋亡后活化的HSC数量显著降低，ECM分泌减少，HF可自发性逆转。王慧利等[27,30]研究发现，将miR-15b、miR-16转染到活化的HSC后发现，线粒体相关抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达减少，miR-15b、miR-16 可降低Bcl-2的表达，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，促进HSC的凋亡；进一步将PLV-miR-16转染到活化型HSC后发现，细胞的代谢周期发生紊乱并受到抑制，细胞凋亡增加，并发现miR-16能降低细胞周期蛋白D1的表达，从而抑制细胞增殖，促进激活后的HSC凋亡。Sekiya等[25]研究结果显示，miR-195高表达可促进其与细胞周期蛋白3′-UTR的结合，抑制细胞周期 G1/S期转化，从而抑制HSC的活化与增殖，促进HSC的凋亡。Wang等[20]研究发现，miR-29能使细胞周期蛋白D1和p21cip1的表达水平下调，阻滞HSC的代谢周期G1期向S期发育，诱导Caspase和PARP凋亡基因水平高表达，促进HSC凋亡。miR-21可通过抑制其靶基因PTEN的表达，抑制HSC的活化，促进HSC的凋亡，抑制ECM的产生与沉积[19]。

HSC活化过程中共10种miRNAs表达升高，9种miRNAs表达降低。进一步研究发现，促纤维化细胞因子血小板衍生生长因子BB可诱导促进miR-21表达，抑制靶基因PTEN表达，诱导AKT 激酶活化，促进HSC由静止型转化为活化型。miR-15b、miR-16表达改变可通过抑制Bcl-2表达，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9来诱导、促进HSC凋亡。miR-21是HSC的调控机制中PTEN信号通路的靶基因，对AKT 激酶发挥抑制作用，能抑制HSC活化、诱导HSC凋亡。

综上所述，miRNAs通过调控HSC的活化、增殖以及凋亡，参与HF的发生发展。miRNAs可直接或通过TGF-β1/Smad、Raf/ERK1、PI3K/AKT、JAK/STAT、PTEN/PI3K/AKT等信号转导通路促进HSC的激活。miR-19b、miR-150、miR-194、miR-146a、miR-29等可抑制HSC的增殖。miR-9、miR-150、miR-146、miR-17等可通过调控TGF-β1/Smad信号通路，调控HSC的增殖。miRNAs可抑制Bcl-2、细胞周期蛋白D1表达，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，促进HSC凋亡。