急性髓系白血病患儿骨髓中miR-34表达变化及其与预后的关系

李晖，陈开澜 ，蔡玮

(武汉市妇女儿童医疗保健中心，武汉430016)

儿童急性髓系白血病(AML)是一种异质性很高的血液系统恶性肿瘤，约占儿童白血病的20%[1]。近年来，得益于危险分级治疗、异基因造血干细胞移植等研究的进展，儿童AML的治疗转归得到了很大的提高，3年总体生存率达60%～75%[2～4]。然而，依然有部分患者初始疗效不佳，并且治疗初次缓解患者约1/3可能复发[5]。因此，探寻新颖、有效的诊断和预后标志物，为AML患儿早期选择最佳治疗方案提供依据。microRNA(miRNA)是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类参与基因转录后调控，不具有蛋白质编码功能的小分子单链RNA，是由18～22个核苷酸组成的短序列[6]。研究发现，miRNA在AML的发生、发展、诊断、治疗及预后中都起重要作用[7，8]。miRNA-34(miR-34)在人体中由miR-34a、miR-34b、miR-34c组成。研究证明，miR-34在体外可抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，并可抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，可作为肿瘤治疗和预后的标志物[9～11]。然而，目前miR-34在血液系统恶性肿瘤中尤其在儿童AML中的作用尚不明确，本研究对此进行探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年8月～2013年7月本中心治疗的初发AML患儿81例(AML组)，参考中华医学会儿科学分会血液学组《儿童急性髓细胞白血病诊疗建议》进行诊断和治疗[12]。其中男51例、女30例，年龄4.5～11.1、中位年龄8.5岁；FAB分类为M1型5例、M2型27例、M3型13例、M4型16例、M5型17例、M6型1例、M7型1例；均随访至2016年8月1日，随访38～59个月、中位随访时间48个月。同时纳入年龄、性别相匹配的行骨髓穿刺检查的非血液系统肿瘤疾病儿童28例为对照组，男16例、女12例，年龄5.9～12.5岁、中位年龄10.1岁。其中血小板减少性紫癜18例，诊断依据中华医学会儿科学分会血液学组制定的《特发性血小板减少性紫癜诊疗建议》[13]；感染性疾病8例，诊断依据为美国感染病学会诊断标准[14]；健康志愿者2例，均为骨髓捐赠者。本研究通过本中心伦理委员会批准，受试者家属均签署知情同意书。

1.2 骨髓中miR-34表达检测 采用RT-PCR技术。两组行骨髓穿刺，采集骨髓2～4 mL置于EDTA管中，提取单核细胞。按照RNA提取试剂盒TRIzol Reagent(Invitrogen)的操作说明提取总RNA。利用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，用1%变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA提取的质量。按照One Step PrimerScript miRNA cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录试剂盒操作说明进行RNA反转录，采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (Takara)试剂盒进行定量PCR，并以U6小核RNA作为内参。用2-ΔΔt法计算miR-34a、miR-34b、miR34c的相对表达量，每个样本重复3次实验。用Primer Premier 5.0软件进行miR-34a、miR-34b、miR34c及U6引物设计。miRNA-34a反转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG ACAACCAG、上游引物：ACACTCCAGCTGGG TGGCAGTGTCTTAGCTGG、下游引物：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；miRNA-34b反转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG ATGGCAGT、上游引物：ACACTCCAGCTGGG CAATCACTAACTCCACTG、下游引物：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；miRNA-34c反转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG GCAATCAG、上游引物：ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTG、下游引物：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；U6上游引物：TCGCTTCGGCAGCACATATAC、下游引物：ATGGAACGCTTCACGAATTTGC。根据miR-34a、miR-34b、miR34c相对表达量的中位数分为miR-34a、miR-34b、miR34c低表达、高表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料用中位数(25%～75%)表示，比较采用Wilcoxon秩和检验；用受试者工作特征曲线(ROC)评估miR-34对儿童AML患病风险的预测效能；采用Kaplan-Meier、Log-Rank分析miRNAs与儿童AML总生存期(OS)的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组骨髓中miR-34a、miR-34b、miR-34c表达比较 AML组miR-34a、miR-34b、miR-34c相对表达量分别为0.121(0.039～0.384)、0.170(0.095～0.217)、0.081(0.029～0.241)；对照组分别为0.475 (0.227～0.788)、0.308(0.177～0.407)、0.389(0.171～0.800)。与对照组比较，AML组骨髓中miR-34a、miR-34b、miR-34c相对表达量低(P均<0.05)。

2.2 miR-34a、miR-34b、miR-34c对儿童AML患病风险的预测效能 根据ROC曲线，miR-34a预测儿童AML患病风险的AUC为0.815，95%CI: 0.733～0.897；miR-34b AUC为0.781，95%CI:0.675～0.887；miR-34c AUC为0.819，95%CI:0.723～0.915；三者联合检测预测儿童AML患病风险的AUC为0.839，95%CI:0.741～0.937；取三者联合检测后回归概率中位值作为切割点，敏感度为63.0%，特异度为85.7%。

2.3 miR-34c与AML患儿OS的关系 miR-34a高表达患儿OS为46.2(36.6～59.4)个月、低表达患儿OS为41.2(29.9～52.7)个月，比较差异无统计学意义(P=0.156)；miR-34b高表达患儿OS为44.9(36.5～62.1)个月、低表达患儿OS为41.2(28.4～52.6)个月，比较差异无统计学意义(P=0.117)；miR-34c高表达患儿OS为46.2(39.5～60.9)个月、低表达患儿OS为38.4(28.4～51.8)个月，比较差异有统计学意义(P=0.002)。

3 讨论

miR-34家族成员中miR-34a由位于染色体1p36的转录本编码，而miR-34b、miR-34c共享1个位于染色体11q23的原始转录簇[13]。体外实验中，miR-34a可通过直接靶向程序性死亡配体1(PD-L1)非编码区，调控PD-L1的表达，进而抑制AML[14]。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中，miR-34a表达下调，通过抑制BAX和P21基因表达促进细胞凋亡、抵抗DNA损伤应答减弱和化疗抵抗[15]，表明miR-34a有抑癌作用。此外，miR-34a在多个实体肿瘤(结肠癌、神经胶质瘤、胃癌等)组织中低表达[16]。本研究结果显示，miR-34a在AML患儿骨髓中低表达，与成人AML类似[14]。此外，本研究发现miR-34a表达与患儿OS不相关，可能因其对化疗敏感度影响较小。

在AML 3细胞系中，miR-34b通过直接靶向热休克蛋白转录因子，调控Wnt-β-catenin通路和热休克蛋白27的表达，进而抑制肿瘤细胞[17]。miR-34b在AML患者骨髓细胞中低表达，且体外实验发现miR-34b表达上调会引起细胞周期异常，抑制基质非依赖性生长，调控环腺苷酸响应因子结合蛋白表达，进而起到抑癌作用[18]。因此，miR-34b在许多肿瘤(结肠癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、成人AML等)组织中低表达[16,18]。本研究发现，相对于对照组，AML患儿骨髓中miR-34b表达下调。本研究同时发现miR-34b骨髓表达与患儿OS不相关，可能因其对化疗敏感度影响较少。

miR-34c在多种肿瘤(喉部鳞癌、结肠癌、乳腺癌)组织中发挥抑癌作用[19～21]。在鼻咽癌组织中miR-34c直接靶向MET基因，从而抑制肿瘤生长和转移[22]；在子宫内膜癌组织中miR-34c直接通过靶向E2F3蛋白基因，抑制细胞分化、迁徙，并诱导细胞周期异常，从而实现抑癌作用[23]。此外，miR-34c在CLL发生发展中起重要作用[24]。本研究发现，miR-34c在AML患儿骨髓中呈低表达，与研究结果一致[25]。miR-34a、miR-34b、miR-34c联合检测进行儿童AML患病风险预测，敏感度和特异度较高，提示miR-34家族在诊断儿童AML中的潜在作用。除此以外，本研究还发现，骨髓miR-34c表达与AML患儿的长期预后相关，miR-34c高表达的患儿OS更长，与相关研究[25]结果相符。这可能与miR-34c的抑癌作用、提高化疗药物敏感度有关[9,16]。

综上所述，AML患儿骨髓中miR-34a、miR-34b、miR-34c低表达，三者联合检测可作为儿童AML潜在的诊断标志物；且miR-34c表达与患者OS相关。本研究尚存在不足之处，样本量较小、单中心研究。因此进一步研究方向为进行多中心、前瞻性大样本的队列研究，以更加深入全面评估miR-34在AML患儿诊断和预后中的作用。

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