G0S2基因在食管癌组织中表达变化及对癌细胞增殖、凋亡的影响

祝铖，李莲，唐俊明，张蕾，郑飞

(湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000)

G0S2基因最早发现于血液单核细胞[1]。早期研究认为，G0S2基因在调节细胞周期及细胞增殖方面有重要作用[2]。研究发现，G0S2基因能够与其他蛋白相结合来发挥自身生物学效应，如通过结合B淋巴细胞瘤-2基因促进肿瘤细胞凋亡[3]。G0S2基因可能具有抗癌作用，但尚未得到验证。食管癌组织中存在G0S2基因甲基化现象，其因甲基化而沉默[4]，提示G0S2基因消除甲基化恢复表达可能成为治疗食管癌的新途径。本研究观察食管癌组织中G0S2基因的表达情况，并观察G0S2基因高表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响，为防控食管癌提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料来源 2016年3月～2017年4月本院手术切除的45例份食管癌组织(患者男40例、女5例，年龄47～70岁、中位年龄59岁，术前均未行放化疗)及其相应的癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)，均经病理检查证实，于液氮中冻存。TRIzol试剂、DEPC水购于美国Sigma公司；RNA逆转录试剂盒购于美国赛默飞公司；RT-PCR上、下游引物及GAPDH引物均购于武汉金开瑞生物工程公司；琼脂糖粉购于Lonza公司；食管癌KYSE-70细胞购于中国科学院上海细胞所；G0S2腺病毒裂解液与空载体由本院临床医学研究所提供；甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷试剂购于Sigma公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰酶等均购于美国Gibco公司。

1.2 食管癌及癌旁正常组织中G0S2基因表达检测 采用qRT-PCR法。按照TRIzol试剂说明书提取组织RNA，根据RNA逆转录试剂盒说明书对已提取的RNA进行逆转录。G0S2行qRT-PCR扩增，上游引物：5′GGCCTGATGGAGACTGTGTG3′、下游引物：5′CTTGCTTCTGGAGAGCCTGT3′，全长115 bp。GAPDH上游引物：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′。qRT-PCR反应体系10 μL,反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸32 s，共40个循环。读取各样本Ct值，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.3 KYSE-70细胞培养及处理 用含10%胎牛血清的RPM 1640培养基培养KYSE-70细胞，置于37 ℃、5% CO2、湿度适宜的培养箱中。待细胞长至70%～80%时，随机分为空白组、Ad-Null组、Ad-G0S2组及0、25、50、100 μmol/L 5-氮杂-2-脱氧胞苷组。Ad-Null组、Ad-G0S2组分别转染Ad-G0S2、Ad-Null，0、25、50、100 μmol/L 5-氮杂-2-脱氧胞苷组分别给予0、25、50、100 μmol/L浓度的甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷进行处理。将各组细胞继续培养24 h。用 qRT-PCR技术检测各组G0S2mRNA表达，方法同1.2。转染后及经5-氮杂-2-脱氧胞苷处理后细胞内G0S2mRNA相对表达量升高，说明实验成功。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。收集各组细胞接种于96孔板，每孔1.0×104/mL，每组设置5个复孔。培养结束后向每孔滴加CCK-8试剂10 μL，孵育2 h。用酶标仪测定450 nm波长下各个孔的吸光度值。

1.5 细胞凋亡率检测 采用Annexin V-FITC/PI双染法。取各组细胞用4 ℃预冷无菌PBS洗涤2次，并用0.25%的胰酶(含0.02%EDTA)消化离心，用Binding Buffer 200 μL重悬细胞，调整细胞为(2～5)×105/mL，取细胞悬液195 μL，加入Annexin V-FITC 5 μL，轻轻混匀后间隔3 min再加入PI 10 μL，混匀，室温避光孵育10 min。在反应管中加入无菌PBS 300 μL，混匀。上机检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1 G0S2基因在食管癌组织和癌旁组织中的表达比较 G0S2基因在食管癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为31.9±7.8、1，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 G0S2对KYSE-70细胞增殖的影响 空白组、Ad-Null组、Ad-G0S2组及0、25、50、100 μmol/L 5-氮杂-2-脱氧胞苷组吸光度值分别为0.99±0.05、0.91±0.12、0.56±0.17、0.87±0.08、0.75±0.03、0.68±0.06、0.60±0.02。Ad-G0S2组吸光度较其他两组低(P均<0.05)，空白组与Ad-Null组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)；随5-氮杂-2-脱氧胞苷浓度升高，吸光度值逐渐降低，细胞增殖活力下降(P均<0.05)。

2.3 G0S2对食管癌KYSE-70细胞凋亡的影响 空白组、Ad-Null组、Ad-G0S2组及0、25、50、100 μmol/L 5-氮杂-2-脱氧胞苷组细胞凋亡率分别为3.2%±2.8%、3.6%±2.1%、12.1%±1.8%、1.3%±0.4%、4.1%±1.7%、7.3%±1.9%、9.5%±1.1%。Ad-G0S2组细胞凋亡率较其他两组高(P<0.01)，空白组与Ad-Null组凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)；随5-氮杂-2-脱氧胞苷浓度升高，细胞凋亡率升高(P<0.05)。

3 讨论

研究表明，G0S2基因能调节细胞增殖分化，促进癌细胞凋亡，抑制肿瘤发生发展等；调节细胞由G0期向G1期转化，细胞进入G1期后诱导G0S2基因瞬时表达，G0S2反过来抑制细胞由G0期进入G1期，从而能使细胞稳定增殖和分化[5]。细胞只有正常地表达G0S2基因，才能够正常、稳定地进入细胞分化的过程[6]。最近有研究指出，接受造血干细胞移植的患者，其外周血单核细胞中的G0S2基因表达明显上调[7]。研究发现，胶质瘤患者中癌细胞G0S2基因低表达，与胶质瘤细胞的发生发展密切相关[8]。以上说明G0S2基因对细胞增殖有重要的稳定和调控作用。抑癌基因失活是癌症发生的重要因素之一[9]，而抑癌基因的启动子区发生甲基化是其失活的重要环节[10]。癌组织与正常组织中的G0S2基因甲基化程度存在明显差异，因此G0S2基因的表达水平亦存在明显差异[11]。近年来研究发现，G0S2基因的启动子区因发生高甲基化而沉默，呈低表达，从而导致癌症的发生，在头颈部癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症中均已被发现并证实[12]。最近在皮肤鳞癌组织中也发现G0S2基因因甲基化而沉默的现象[13]。研究发现，人慢性髓系白血病细胞的G0S2基因调控序列和外显子区因处于高甲基化的状态而沉默，使用特定的去甲基化试剂后发现，细胞增殖活性降低[14]；相反利用特定技术使G0S2基因沉默，则促进癌细胞增殖。有研究用shRNA使大肠癌细胞的G0S2基因沉默，发现大肠癌细胞增殖活力明显提高[15]。由此可见，一方面甲基化现象在癌症中广泛存在，如何消除甲基化使G0S2基因正常、稳定地表达从而发挥抑癌作用，是癌症高效治疗的关键所在。另一方面说明G0S2基因高表达治疗食管癌具有一定的理论依据；且食管癌的传统治疗方案效果欠佳，食管癌患者5年生存率较低，生活质量差。目前对G0S2基因在食管癌治疗中作用的研究较少，以此为研究方向可能成为食管癌高效治疗的突破口。本研究结果显示，食管癌组织中G0S2基因呈低表达，证明食管癌的发生可能与G0S2基因低表达有密切关系；通过转染及甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷使G0S2基因过表达后两种方法，G0S2基因能够抑制食管癌KYSE-70细胞的增殖，促进其凋亡。

G0S2基因正常表达是抑制食管癌细胞增殖、促进其凋亡的重要因素；如何消除甲基化从而使G0S2基因正常、稳定地表达可能是预防和治疗食管癌的研究热点。G0S2基因的甲基化修饰及其在食管癌发生、发展中如何发挥作用有待进一步的研究。

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