妇产科专科生物样本库的建设和管理

李 倩，金莉萍

生物样本库也叫生物银行，主要是指标准化收集、处理、储存和应用健康和疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本以及与这些生物样本相关的临床、检验、治疗、随访、知情同意等资料及其质量控制、信息管理与应用系统[1]。生物样本库的主要优势是快速高效地访问集合的人类生物材料和相关的临床信息。这些收集和保存完好的资源能节约重大研究成果的时间从而提高研究的竞争力，并加速推动科学进步[2]。

作为一家三级甲等妇产科专科医院，上海市第一妇婴保健院拥有丰富的妇科和产科疾病资源。为了收集及整合各临床科室分散的临床疾病资源，我院于2014年底开始筹建面对全院各临床科室的生物样本库。主要职能是标准化、高质量地采集、处理、储存和利用组织、血液、体液等妇产科临床疾病资源，为妇产科相关疾病的临床研究提供科研材料。高质量的保存临床样本，形成样本库动态存储和使用的模式，促进临床样本资源对医院临床研究和基础科研的支持，带动临床、科研和教学工作[3]。

目前我院已建成分区明确、布局合理、功能齐全的规范化样本库场地。收集范围包括产科、妇科、乳腺肿瘤、出生缺陷、习惯性流产等方面的标本。样本库的职能包括肿瘤组织和血液、脐带血、胎盘、绒毛、胸腹水、羊水等标本的前处理；核酸蛋白提取纯化和质量控制；病理蜡块和切片的制备和质控；组织芯片的制备等。建立了一套标准化、规范化的样本采集、处理和储存操作流程和质量管理体系。作者主要介绍在妇产科专科生物样本库建立过程中所积累的经验和遇到的问题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 场地 生物样本库位于门诊楼三楼，设有分区和功能明确的独立专属场地，按功能分为样本接收间、样本处理实验室、RNA实验室、细胞实验室、超低温冰箱间、液氮储存间等功能区，其中样本接收间主要用于临床标本的接收和暂存、样本信息资料录入等，样本处理实验室能完成对样本的初步处理(如离心、分装等)，根据特殊样本处理需求亦可在样本处理实验室、细胞实验室、RNA实验室完成对样本的深度加工(如核酸与蛋白的提取、细胞的培养与保存等)，样本存储区(超低温冰箱间和液氮储存间)的储存规模可达百万份(图1)。

图1 生物样本库功能分区布局示意图

1.1.2 设备和试剂耗材

1.1.2.1 样本处理和储存设备 生物安全柜(美国Thermo公司)、台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、血液离心机(德国Sigma公司)、低温标签打印套装(美国Brady公司)、移液器套装(德国Eppendorf公司)、高压灭菌锅(日本三洋公司)、制冰机(日本三洋公司)、核酸提取纯化系统(北京百泰克公司)；样本质控设备：Nanodrop one紫外分光光度计(美国Thermo公司)、生物分析仪(美国安捷伦公司)；样本储存设备：超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)、温湿度监控系统(青岛海尔特种电器有限公司)、气相液氮罐(美国MVE公司)。

1.1.2.2 试剂耗材 真空采血管(江苏康健医疗用品有限公司)、无菌注射器(江苏康健医疗用品有限公司)、冻存管(上海万格科学器材有限公司)、冻存盒(上海万格科学器材有限公司)、RNAlater保存液(美国Ambion公司)、核酸提取试剂盒(北京百泰克公司)、蛋白定量试剂盒(美国GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 组织建设和人员培训 参照国内较成熟样本库的建设模式，结合医院自身特点，样本库组织架构由5部分组成：管理委员会、学术委员会、伦理委员会、生物安全评审委员会、执行机构。在此基础上安排专人分别负责样本的采集和前处理、核酸蛋白提取和质量管理、样本信息数据管理、样本出入库和常务管理等，并按照岗位职责的不同给予相应的培训内容、方式、要求和频率，定期参加生物样本库标准化建设会议[4]。

1.2.2 知情同意书的签署 样本库的建立和知情同意书的内容均经过院伦理委员会审查，严格保护患者隐私和权益[5]。样本库收集标本必须先征得患者的知情同意，主要是同意收集其血液样本、手术切除的组织样本或分娩后的胎盘附属物等以及相关临床诊疗信息用于科学研究。为方便和患者沟通，签署知情同意书主要由经治医生在术前谈话时完成。

1.2.3 血液标本的采集和处理 术前血采集由病房护士完成，脐带血由样本库人员在剖宫产术中抽取，抗凝血样(乙二胺四乙酸抗凝管)和非抗凝血样(无添加剂)各采集1管，每管5 mL；经1 600 g离心15 min后分离血清、血浆、血凝块，并通过淋巴细胞分离液提取外周血单核淋巴细胞后分别装入冻存管并保存在-80 ℃冰箱中，整个过程要求在2 h内完成。

1.2.4 组织样本的采集和处理 组织样本的采集在手术室标本离体后进行，妇科标本取肿瘤、癌旁和正常组织，产科标本取胎盘、脐带、胎膜组织，采集并分装完成后立即置于液氮中速冻或放入RNAlater保存液中保存。为保证组织标本的质量，从组织离体到组织冻存的时间最长不超过30 min[6](图2)。

注：N代表正常组织；P代表癌旁组织；T代表癌症组织图2 妇科肿瘤组织样本的处理流程

1.2.5 样本接收和入库管理 工作人员在接收样本前核对样本、知情同意书和样本采集登记表，确认无资料缺失、信息不符、样本泄露或质量问题后方能接收。将样本信息录入样本库管理系统后，系统根据样本库定义的规则辅助生成样本编号并自动生成二维条形码，自动为多个样本复份分配储存位置，完成样本的入库。

1.2.6 样本资源的使用和出库 为规范样本库标本的申请和使用，合理、有效地发挥资源优势，督促样本的使用和产出，院内外申请者使用样本前，必须填写样本申请表，并经过院伦理委员会、科教科等审核通过后样本方能出库。样本出库前，样本管理人员在管理系统中按条件筛选出符合申请者要求的样本，选择出库并打印出库单，按照出库单上的样本储存位置在相应冰箱/液氮罐中取出样本，复核无误后完成样本的交接。

2 结果

2.1 样本和信息收集情况

2.1.1 样本收集情况 样本库建设之初，主要以收集妇科各类恶性肿瘤的组织和血液标本为主。随着样本库场地的扩大和各类软硬件设施的完善，医院内部各个科室对样本库作用和地位日益重视，各科室积极主动地配合各类有研究意义病种的样本收集和保存工作。在此基础上我们分别建立了针对医院各个科室的不同类样本的收集和保存流程。目前样本库的收集范围涵盖了妇科、产科、生殖免疫科、辅助生殖科、新生儿科、儿童保健科等科室的多个病种。现已库存29个病种70 000余份样本，所有样本在收集前患者均签署了知情同意书(图3)。

图3 生物样本库历年样本总数和病种数统计

2.1.2 样本信息收集情况 样本库采用朗珈样本库管理系统，通过医院信息科，实现了样本库管理软件与住院医生工作站、病理系统、检验系统、手麻系统、影像系统等的对接，可将患者的基本信息以及相关诊疗信息自动导入样本库管理软件。临床随访信息的采集和登记由专人管理，样本库定期收集样本随访信息并将其录入样本库管理系统。

2.2 样本的质量控制 获取高质量的样本和相关临床资料对于基础医学和转化医学研究至关重要。为了保证样本的质量，样本库参照国外的标准化建设指南[7-10]，建立了一套符合妇产科疾病特色的样本库质量管理体系文件，规定了对不同类型标本的质控流程和标准以及样本的抽检方案。根据病种类型、样本类型、储存方式的不同，采用随机抽取的原则，每月对新入库肿瘤组织标本100%进行形态学检测，随机抽取5%的新入库样本进行分子质量检测，随机抽取10%的新入库样本进行信息核对。

2.2.1 组织形态学质量检测 主要针对妇科肿瘤组织做形态学质控，对样本进行病理形态学评估，在镜下观察肿瘤组织病理形态学信息，包括肿瘤成分比例、是否有组织坏死、是否有淋巴细胞浸润等[11]。对于冷冻组织样本，在手术室取材时，单独留取一块组织速冻，取材完成后制作冷冻组织切片，染色后镜下进行病理形态学质控。对于石蜡组织样本，在常规石蜡取材时，单独留取一块组织，制作石蜡组织切片，苏木精-伊红染色后进行病理形态学质控。镜检下肿瘤成分比例在60%以上视为肿瘤取样合格。

2.2.2 分子学质量检测 主要从样本中提取DNA、RNA和蛋白质，检测其浓度、纯度和完整性[12]。核酸提取用全自动核酸提取仪，自动化提取样本中的DNA/RNA，然后用超微量分光光度计检测DNA/RNA的浓度和纯度，用生物分析仪检测DNA/RNA的完整性。采用TCA(三氯乙酸)-丙酮沉淀法人工提取组织中的蛋白质，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度和总量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测蛋白。从样本库的组织样品中提取的蛋白质浓度均大于1 μg/μL，总量均大于100 μg，蛋白条带分明，未发生明显降解(图4)，可满足后续科研应用。

图4 蛋白SDS-PAGE电泳结果

2.2.3 样本信息质控 对样本信息进行随机抽检，每个月从新入库的样本中抽取10%进行样本相关信息和位置核对，主要检查样本相关临床信息是否正确和完整、是否有随访信息、样本条码是否正确、实体库与虚拟库的位置是否一一对应，相关样本记录是否完整。经随机抽检和核对，95%以上样本信息完整，约99%的样本位置信息正确。

2.3 样本库取得的科研成效 样本库出库的样本和信息支持了我院国家自然科学基金、上海市科委、上海市卫计委、同济大学医学院等各个级别科研课题的立项。以2016年为例，生物样本库共支持了6项国家自然科学基金资助课题的研究。样本库的出库量约占同时期样本入库量的8%。同时，生物样本库已获得关于样本取材、转运和保存方面的3项专利授权。

3 讨论

3.1 建设妇产科专科生物样本库的意义 目前女性生殖系统很多疾病发病机制不明，缺乏大规模流行病学调查数据，诊治困难，缺乏诊治规范，亚学科亟待发展。尤其是乳腺肿瘤和妇科肿瘤是严重危及人类生命的疾病之一，多年来一直是临床和基础研究领域最受关注的问题。研究妇科肿瘤生物学特性、临床治疗的有效性、防止肿瘤的复发和转移是亟待解决的难题。生物样本库可以为相关研究提供病变和正常对照标本以及相关的临床数据。科研人员可通过对海量数据的研究，获知疾病的发病机制、发现新的疾病诊断和治疗标志物，从而发现新的疾病干预、检测和治疗方式。生物样本库在妇产科临床和基础研究中的作用越来越被人们所重视。

3.2 规范样本收集流程，保证样本来源是生物样本库运行的难点 由于样本收集范围涉及到全院各临床科室，样本的采集工作需要临床医护人员配合。由于临床医护人员不熟悉样本收集流程和操作规范，常造成知情同意书的签署不规范、样本漏收、样本延迟运送造成的质量问题等。经过与临床相关人员的沟通，不断完善和规范临床样本收集流程，使之更好地适应临床现有流程，如妇科肿瘤患者的血液采集可安排在术前一天和检验科抽血一起进行，以减少患者痛苦。通过几次集中地针对全院临床医护人员的样本收集流程和操作规范培训，样本的临床采集流程问题得到了解决，知情同意书的签署、临床样本的收集、样本的运送流程得到了很好地衔接。

与其他肿瘤相比，妇科肿瘤病理类型多、病灶小且不明显，因此存在各类样本取材不规范的问题，直接影响了所收集样本的质量。特别对于肿瘤组织样本，取材的准确性直接影响了科研结果的可靠性[13]。而对于产科标本，如羊水、胎盘、绒毛等类型标本的收集，由于缺乏收集经验，故需查阅相关文献，并同产科相关科研人员沟通确定样本收集的目标和以后的应用方向，确定样本收集和前处理、保存方式。建立各类样本的标准化操作流程，对样本从取材、运输、处理到保存的每个步骤均有标准化的规定，以保证样本在采集及储存期间能够保持其生物学稳定性，可用于进一步实验研究[14]。对于妇科肿瘤组织样本，取材人员需通过我院病理科为期3个月的妇科肿瘤取材培训，通过后方能上岗，以保证组织取材的准确性。

3.3 样本库持续有效运营亟需解决的问题 目前我院生物样本库建设的资金主要来源于医院自筹资金，服务对象主要是医院内部的研究人员。而样本库的长期稳定运行需要充足可靠的资金来保障。样本库进入惯性运营阶段后，对外开放服务收费可作为日常管理费用的有效补充[15]。因此，建立样本库对外开放合作和收费机制，对样本库可持续发展和运营具有积极意义。遗憾的是，在样本库对外共享和收费模式方面，目前国内并没有可借鉴的条例和规范。现状是医院外的研究者较难获得医院生物样本库的资源，共享机制尚未完善[16]，卫生行政管理部门对生物样本库的监管缺失。为此，建议我国应通过政府相关部门尽快制定相关运营和管理规范，加强生物样本库的管理规范制定和运行监管，促进生物样本库科学、有序发展，使生物样本的有限投入发挥更大作用。

[1] Liu A,Pollard K.Biobanking for personalized medicine[J] .Adv Exp Med Biol,2015,864:55-68.

[2] 季加孚.精准医学时代肿瘤样本库的规范化建设[J] .浙江大学学报,2016,45(4):331-334.

[3] 张连海，季加孚.大数据时代的疾病样本库[J] .中华胃肠外科杂志,2015,18(1):6-8.

[4] Carpenter JE,Clarke CL.Biobanking sustainability--experiences of the Australian Breast Cancer Tissue Bank (ABCTB)[J] .Biopreserv Biobank,2014,12(6):395-401.

[5] 王敏，高志梅，吕志金，等.儿童专科医院特色生物样本库的建立与应用[J] .中国医药生物技术,2016,11(3):280-284.

[6] Baker M.Biorepositories: building better biobanks[J] .Nature,2012,486(7401):141-146.

[7] Welsh S,Peakman T,Sheard S,et al.Comparison of DNA quantification methodology used in the DNA extraction protocol for the UK Biobank cohort[J] .BMC Genomics,2017,18(1):26.

[8] Ciaburri M,Napolitano M,Bravo E.Business planning in biobanking:how to implement a tool for sustainability[J] .Biopreserv Biobank,2017,15(1):46-56.

[9] Haslacher H,Szekeres T,Gerner M,et al.The effect of storage temperature fluctuations on the stability of biochemical analytes in blood serum[J] .Clin Chem Lab Med,2017,55(7):974-983.

[10] Ost JA,Newton PW,Neilson DR,et al.Progressive consent and specimen accrual models to address sustainability:a decade’s experience at an oregon biorepository[J] .Biopreserv Biobank,2017,15(1):3-8.

[11] 杜祥，孙孟红.恶性肿瘤生物样本库标准操作流程[M] .上海：复旦大学出版社，2016:122-132.

[12] Caixeiro NJ,Lai K,Lee CS.Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens:a systematic review[J] .J Clin Pathol,2016,69(3):260-265.

[13] Schmitt S,Kynast K,Schirmacher P,et al.Challenges for quality management in implementation,maintenance,and sustainability of research tissue biobanks[J] .Virchows Arch,2016,468(1):93-99.

[14] Shabihkhani M,Lucey GM,Wei B,et al.The procurement,storage,and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology,biorepository, and biobank settings[J] .Clin Biochem,2014,47(4-5):258-266.

[15] 郭渝成.临床生物样本库[M] .北京：科学出版社，2014:1-7.

[16] 王剑萍,蔡美玉,孙孟红,等.上海市公立医院生物样本库的现状分析[J] .中华医学科研管理杂志,2016,29(5):C2-C4.