长链非编码RNA 在食管癌中的研究进展

李国良 朱明闯 熊鹏 朱珉

华中科技大学同济医学院附属同济医院胸外科（武汉430030）

在世界范围内食管癌是第八大常见癌症，也是主要致命的恶性肿瘤，整体5年生存率从15%～20%不等［1］。食管癌（EC）有两种组织学形式：食管腺癌（EAC）和食管鳞状细胞癌（ESCC）。ESCC 通常是由于正常食管鳞状上皮细胞不典型增生逐渐演变而来，而EAC 是由于肠上皮细胞化生或是由食管下段复层上皮经Barrett 食管（BE）慢慢演变而来，近年来，EAC 的发病率有升高趋势。我国中北部是食管癌的高发地区，主要是以ESCC 为主，据有关研究报道所有与食管癌有关的死亡中有一半以上发生在中国［2-3］。基于我国的现状，亟需寻找食管癌新的诊断方法和治疗手段。

目前随着转录组学的深入研究、高通量测序技术的发展，人们发现98%的基因被转录成非编码RNA（ncRNA），而在生物进化过程中这些基因都被保留了下来，这使传统的基因表达调控模式受到严峻的挑战。此外，目前已知的ncRNA 有76%被转录成lncRNAs，并且具有组织特异性［4-5］。已有研究证明lncRNAs 在表观遗传调控中发挥核心作用，同时参与基因转录，转录后调节和蛋白质的翻译后修饰等［6］。目前，有大量与食管癌相关的lncRNAs 被鉴定出来，广泛存在于血清、血浆、尿液和脑脊液等体液中，与食管癌的发生和发展有密切关系［7］。本文重点总结与食管癌相关的lncRNA 的功能和分子调节机制，并讨论他们在食管癌诊断和治疗上的应用。

1 LncRNA 的结构及分类

根据链的长短不同，ncRNA 可以分为长度在50 nt 之内的短链ncRNA，50～200 nt 的中链ncRNA 和大于200 nt 的lncRNA。与另外两种ncRNA 相比较，lncRNA 具有数量多，类型多以及作用模式多的特点［8］。根据功能，lncRNA 可分为信号型、诱饵型、指导型和支架型。根据基因组中的位置可分为基因内（intronic）lncRNA、基因间（intergenic）lncRNA、正义（sense-overlapping）lncRNA、反义（antisense）lncRNA、双向（bidirectional）lncRNA 五类。 基因内lncRNA起源于内含子区域，在前体mRNA 剪接时产生，其序列不与外显子重叠；基因间lncRNA 是起源于两个蛋白质编码基因之间，但与最近的蛋白质编码基因间隔大于10 kb；正义lncRNA 与蛋白质编码基因转录同向，序列可以重叠多个内含子与外显子；反义lncRNA 是反义转录物，其转录方向与蛋白质编码基因相反，序列至少重叠一个外显子；双向lncRNA 转录起始位点距离蛋白质编码基因启动子位置小于1 000 bp，转录方向相反［9］。

2 LncRNA 在ESCC 中调控机制

2.1 转录调节作用 真核生物的转录具有空间和时间的特异性，机制非常复杂。转录起始时通常需要各种蛋白因子如转录因子（TF）与RNA 聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物（TIC），因此TF 活性变化可以影响靶基因的转录过程。β-catenin 最初被发现是一种粘附因子，但是研究人员现在已经发现β-catenin 是一种多功能蛋白，在Wnt∕β-catenin 信号通路的一个关键组分，并且可以作为TF 与ESCC 相关的lncRNA 发生相互作用［10］。据报道［11］lncRNA UCA1（尿路上皮癌相关1）是一种在ESCC 中表达水平下调的lncRNA，其失调可促进细胞增殖，迁移和侵袭。LncRNA UCA1 过表达可以使细胞核中β-catenin 活性降低，并因此抑制Wnt ∕β-catenin 信号通路的传导，从而下调下游的癌基因c-Myc 的表达，这一结果显示lncRNA UCA1 通过抑制β-catenin 的活性起到抑癌的作用，因此如果检测出患者体内lncRNA UCA1 表达量降低，说明患ESCC 的可能性较高。

E2F1 是一种与细胞周期相关的转录因子，被激活后可使细胞由G1 期向S 期转变。CHEN 等［12］发现lncRNA ANRIL 在ESCC组织中的表达水平较正常组织显著升高，当其被沉默后，E2F1 表达明显降低，并上调p15INK4b和转化生长的表达因子β1 基因的表达。因此不难发现促癌基因lncRNA ANRIL 是通过TGFβ1∕Smad 经典信号通路调控ESCC 细胞的增殖。

2.2 转录后调控作用 真核生物基因的表达不仅可以通过转录方式进行调控，也可以通过加工修饰RNA 进行转录后调控，而有些lncRNA 可以参与mRNA 的剪接和修饰或者充当竞争性内源RNAs（ceRNAs）调控各项生命活动。WU 等［13］在全基因组水平上研究了位于ESCC 易感位点上的lncRNAs 对患病风险和预后的影响，结果从326 例确诊ESCC 患者的标本中鉴定出lincRNA-uc002yug.2，并测得其在癌组织中普遍过表达，此外发现lincRNA-uc002yug.2 在细胞核中促进RUNX1（Run-ralated transcription factor 1）和选择性剪接因子的复合体形成，以产生更多的RUNX1a；同时减少CEBPα（CCAAT 增强子结合蛋白-α）基因表达，最终促进ESCC 的进展。

ceRNA 是一种新的基因表达调控模式，而非一种新的RNA 分子。在这个模式中，编码RNAs 和ncRNAs（lncRNA，cirRNA 和假基因）之间相互作用从而更有效实现编码RNA 和ncRNA 之间的信号传导，进而调节靶基因的表达［14］。LI 等［15］发现miR-301a 可以作为分子海绵直接与lncRNA GAS5 作用，调控趋化因子CXCR4 的表达，参与ESCC 细胞的增殖和生长。lncRNA MALAT1 可受miR-101和miR-217 两种基因的影响而表达下降，进而下调细胞周期相关基因（如p21，p27 和B-MYB）和转移相关基因（如MIA2，ROBO1 和CCT4）的表达，最终起到抑制细胞增殖，迁移和侵袭的作用［16］。

翻译后修饰（PTM）是指mRNA 翻译成的多肽链经化学修饰（如甲基化、磷酸化、泛素化等）和酶促反应后形成成熟蛋白质的过程。HU 等［17］研究显示lncRNA MALAT1高表达可促进ATM-CHK2 细胞周期调节信号通路中ATM，CHK2，CDC25C 和CDK1 等蛋白的去磷酸化，调控肿瘤细胞的增殖。YOON 等［18］报道lncRNA LUCAT1 通过上调UHRF1（泛素样含PHD 和环指域蛋白）泛素化肿瘤抑制因子DNMT1（DNA 甲基转移酶1），导致ESCC 的发生和转移。LÜ等［19］研究发现LncRNA MEG3 具有类似作用，可以下调MDM2（一种E3 泛素连接酶）减低其对P53 泛素化降解的作用，从而抑制ESCC 细胞的增殖和侵袭。

2.3 表观遗传学修饰作用 表观遗传是指在没有细胞核DNA 改变的情况下，基因功能可逆和可遗传的改变。这些修饰改变包括：染色质重塑，DNA 的甲基化和组蛋白修饰［20］。

染色质重塑复合物被lncRNAs 招募到特定基因组位点是基因表达调控和癌症发病机制的常见现象。已有研究报道［21］，20%的lncRNAs 与具有组蛋白甲基转移酶活性PRC2（polycomb repressive complex 2）相关，其中染色质重组复合物EZH2（组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶）是PRC2 的功能性酶的重要组成成分。LncRNA POU3F3 位于其靶基因POU3F3 上游约4 kb 处，它可以募集EZH2，将DNA 甲基转移酶聚集到POU3F3 的启动子中，使启动子致密超甲基化。ESCC 中上调的lncRNA POU3F3 进一步增加POU3F3的甲基化水平，降低其表达，进而促进肿瘤的发展［22］。

WANG 等［23］发现lncRNA MALAT1 也可以与EZH2 相互作用，在体外实验中，沉默lncRNA MALAT1 后上调EZH2 表达，从而抑制β-catenin 和Lin28 蛋白的合成，通过经典的Wnt∕β-catenin 通路调控癌细胞增殖、分化、侵袭和转移。

DNA 甲基化是最早的表观遗传学修饰之一，它通过改变染色质的结构，DNA 构象，DNA 的稳定性以及DNA与蛋白质的相互作用来控制基因的表达。一般情况下，DNA 的甲基化会抑制基因的表达，修饰的部位主要发生在CpG 位点。LOC100130476 是含有3 个CpG 岛的lncRNA［20］。GUO 等［24］发 现lncRNA LOC100130476 在ESCC 中 因 外 显子1 中的CpG 位点高甲基化而低表达，该研究结果显示这种lncRNA 作为ESCC 的肿瘤抑制基因与TNM 分期和癌症细胞的分化程度密切相关。H19 和IGF2（胰岛素样因子2）是连锁交互印记的基因，ICR（imprinting control regions）位于H19 基因启动子上游12 kb 的区域，他可以调控H19 和IGF2 的表达，这三者构成的通路对细胞的增殖有重要作用。GAO 等［25］发现lncRNA 91H 能够促进91H∕ICR 之间的甲基化，进而抑制基因IGF2 的表达，调控ESCC 的进展。lncRNA 91 表达下调的ESCC 患者往往肿瘤浸润深度越大，细胞分化程度越低，但是淋巴结节转移和远处转移情况与其他患者没有显著性差异。

组蛋白修饰是指N-末端发生的各种共价修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化等，这些修饰能够影响组蛋白和DNA 双链的亲和性，间接的导致表型改变。WU 等［26］运用ESCC组织微阵列技术鉴定出lncRNA CASC9 在癌组织中高表达，并与肿瘤的大小，TNM 分期和预后密切相关；机制方面研究发现lncRNA CASC9 是通过招募EZH2 改变组蛋白H3K27me3（H3K27 三甲基化）水平，抑制靶基因PDCD4 表达，促进肿瘤的发生发展的。另有研究报道［27］lncRNA CCAT1 启动子中组蛋白H3K27 的乙酰化使其在ESCC 中高表达，从而发挥促癌作用。

2.4 其他调节机制 单核苷酸多态性（SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。WU 等［13］研究了位于ESCC 易感性位点可能具有功能性SNP 的lincRNAs外显子，鉴定出52个SNPs并用Logistic回归评估了它们与ESCC 发病风险的相关性，发现lincRNA-uc003opf.1外显子中rs11752942A ＞G 位点的基因型频率在患者和对照之间有显著差异。与rs11752942AA 基因型相比，AG 和GG 基因型患ESCC 的风险显着降低（OR= 0.73；95%CI =0.63～0.84）。生化分析表明，与A等位基因相比，rs11752942G等位基因可通过结合micro-RNA-149 在体内和体外下调lincRNA-uc003opf.1 的水平，从而影响细胞增殖和肿瘤生长。这些发现表明lincRNA-uc003opf.1 外显子中的单核苷酸多态性rs11752942A ＞G 可能是ESCC 肿瘤进展的遗传修饰分子。

3 LncRNA 在食管腺癌中的调控机制

相对于ESCC，对EAC 相关的lncRNA 研究较少。随着EAC 的发病率的增加，人们对EAC 相关lncRNA 的关注度也在逐年升高。WU 等［28］运用高分辨率深度测序技术对EAC、BE 和正常食管上皮标本的研究发现lncRNA AFAP1-AS1（6 810 bp）在EAC 和BE组织中极度低甲基化。然后应用qPCR 技术测得lncRNA AFAP1-AS1 在EAC组织和细胞中的表达量明显高于正常组织和细胞，同时细胞功能实验也证明这种lncRNA 在EAC 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭中扮演重要角色。其后LUO 等［29］在ESCC 患者中做了同样研究也发现表达量上调的lncRNA AFAP1-AS1。ZHOU等［30］在验证前人基础上做了Kaplan-Meier 生存分析，发现lncRNA AFAP1-AS1 高表达的患者有较差的预后。因此lncRNA AFAP1-AS1 在ESCC 和EAC 的发生发展中都发挥着重要作用。

YANG 等［31］对正常食管、BE 和EAC组织分别进行了RNA-seq 分析。他们确定了有6 216 个lncRNA 在EAC 中表达，其中61 个lncRNA 在EAC 中表达上调，平均增加8 倍以上。然后选择表达最高的lncRNA HNF1A-AS1（2 455 bp）用于进一步研究，其在4 种EAC 细胞系（Flo-1，OE3，JHUEsoAd1 和SKGT4）表达水平明显高于正常食管细胞（HEEpic），siRNA 沉默后可降低EAC 细胞增殖和迁移侵袭能力，也可抑制细胞周期的进展。该组研究还发现lncRNA HNF1A-AS1 和其同源蛋白编码基因HNF1A 在EAC癌组织和细胞系中表达都是上调的，但是沉默lncRNA HNF1A-AS1 后不能明显影响HNF1A mRNA 和HNF1A 蛋白的表达，这说明它们之间没有直接的联系。除此之外还发现敲除lncRNA HNF1A-AS1 后，经典的食管癌相关lncRNA H19 表达水平显著下调，这种lncRNAs 之间的相关性在食管癌中比较少见。

MAAG 等［32］运用RNA-seq 分析技术研究了BE 在不同阶段转录组学改变，确定了EAC 发生发展的特定基因网络，并鉴定出了4 个标记基因（CTSL，COL17A1，KLF4 和E2F3）可以用来区分EAC 与BE，同时在这个特定的基因网络中找到了685 个失调的lncRNAs，这一研究结果为今后系统研究EAC 相关的lncRNAs 奠定了基础。

4 LncRNA 在食管癌诊治中的意义

食管癌由于起病隐匿，缺乏有效的早期诊断和筛查手段，大部分患者首诊时已到进展期，无法得到及时的治疗，同时亦缺乏合理的预后风险评估手段，从而导致了不良的后果。而lncRNAs 与食管癌发生有着密切联系，有成为食管癌早期诊断和预后评估的标志物的潜力。TONG 等［33］发现ESCC 患者血浆中lncRNA POU3F3 水平明显高于健康人群，联合检测血液中POU3F3 和鳞状细胞癌抗原（SCCA）对早期ESCC 的诊断有重要意义。lncRNA AF-API-AS1 在ESCC 患者中也存在高表达，并且与ESCC 的淋巴结转移，远端转移，临床分期以及放化疗的敏感性有密切联系［30］。lncRNA HOTAIR 也是ESCC 发展和预后的一个重要分子，CHEN 等［34］报道HOTAIR 高表达的患者常伴有癌细胞转移，高TNM 分期和低生存期等比较差的预后状况。因此，如能从lncRNAs 信息网络中挖掘出可用于食管癌早期诊断和预后评估的生物学标志物，那么这将对我国食管癌的防治工作产生巨大影响。

5 展望

全基因组研究表明目前lncRNAs 的已知功能仅仅是冰山一角而不是简单的信息传递分子，它们是具有复杂的调控机制的分子，其延伸范围很广远超出我们的早期愿景。尽管lncRNA 不能编码蛋白质，但它们可以向下游传递信息并调控基因表达，所以在诊断和治疗疾病上，他们作为信息传导分子可能比蛋白质更有敏感性和特异性。目前，lncRNA 的相关研究仍处于起步阶段，有效应用相关先进技术和方案，进一步揭开lncRNA 与食管癌发生发展的关系，有利于人们更好地了解lncRNAs，最终使lncRNAs应用到食管癌的诊治当中。

在这篇综述中，笔者总结了与食管鳞状细胞癌和食管腺癌相关的lncRNAs，阐述了它们在各种生物过程中调控机制。目前，虽然越来越多的lncRNAs 被确定为包括食管癌在内的各种疾病的生物标志物，但是仍然有许多关键性的问题还未解决。未来应当加深对lncRNAs 潜在机制的研究，将研究方向逐渐从分子和细胞水平转向食管癌动物模型，这将有助于发现食管癌的新型诊断和治疗方法。