一株农用拮抗放线菌的分离与鉴定

陈倩倩，边传红，康业斌，赵世民，李淑君

1 河南科技大学林学院，洛阳 471023；

2 河南省烟草公司洛阳市公司，洛阳 471023；

3 河南省农科院许昌烟草研究所，许昌 461000

烟草疫霉（Phytophthora parasitica）引起的黑胫病、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）引起的烟草猝倒病、镰刀菌（Fusariumspp.）引起的根腐病等是世界性土传病害，常发生混合侵染，给我国烟草生产带来严重损失[1-3]。目前防治烟草土传病害主要采用化学防治、抗病育种、栽培管理等措施；然而，烟草高抗品种的缺乏以及长期施用化学农药所带来的环境问题不容忽视[4-5]。近年来，国内外许多学者相继开展了应用拮抗放线菌防治烟草病害的研究。Lukic A等[6]从烟田中分离出28株放线菌，其中两株白色链霉菌(Streptomyces albus)对12种烟草病原真菌均有拮抗作用。Kortemaa等[7]报道了应用放线菌的活体制剂Mycostop防治腐霉菌、疫霉菌、镰刀菌和丝核菌等引起的土传病害。Loqman等[8]从摩洛哥葡萄根际土壤中分离获得142株放线菌，其中24株放线菌至少拮抗尖孢镰刀菌、终极腐霉、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌及白绢病菌中的4种病原菌。陆铮铮等[9]从烟草根围土壤中分离筛选出3株对烟草青枯劳尔氏菌拮抗作用较强的放线菌。随着人们对生态环境和消费品安全性的日渐重视，筛选优势拮抗微生物对烟草病害进行绿色防控已成趋势[10]。本研究从洛阳地区烟草根际土壤中分离、筛选、鉴定出对烟草主要土传病原真菌抑制作用较强的放线菌菌株，旨在为进一步开发防治烟草土传真菌病害的生物制剂提供资源。

1 材料与方法

1.1 土壤、菌株及培养基

土壤样品：采集自河南省洛阳市嵩县田湖镇南安村，地理位置为N34°28′55″，E112°00′55″，H 340 m。红黏土，烟草连作2年。

供试病原菌：烟草疫霉（Phytophthora parasitica）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）均由河南科技大学植物病害分子鉴定与绿色防控实验室提供。

培养基：放线菌的分离培养用高氏一号培养基，放线菌的发酵液制备用大豆酵母培养基，拮抗放线菌的培养性状观察用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、淀粉铵琼脂培养基、蔗糖察氏琼脂培养基、克氏一号琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基以及天门冬素琼脂培养基。放线菌的拮抗活性测定与供试病原菌的培养用PDA培养基。

1.2 方法

1.2.1 根际土样采集

在烟草收获期，随机选取20株健壮烤烟，用铁铲去掉烟株一侧0～5 cm的表土，将烟株根系用铁铲挖出，用小刀将距根2 mm以上的土壤轻轻剥离，抖落其余土壤并用小毛刷将不能抖落的粘附在根上的土轻轻刷下，作为根际土样一并收集。采回的土样室内风干，经研钵研磨后过2 mm孔径的筛子（10目）。

1.2.2 土壤放线菌分离与纯化

土壤放线菌的分离采用涂布平板法[11-12]。将采集的土样制成不同稀释倍数的土壤悬浮液，涂布到含有3% K2Cr2O7抑制剂的高氏一号培养基平板上，然后将平板倒置于28 ℃恒温培养箱中培养7～10 d。每个处理6个重复。待菌落长出，选择放线菌单菌落相对分散、均匀的平板，其所对应的稀释倍数即为最适稀释倍数。挑取平板中形态与颜色不同的单菌落继续进行纯化培养。

1.2.3 拮抗放线菌的初筛

采用平板对峙培养法[13]。选取在高氏一号培养基上生长5 d的放线菌单菌落，用直径为5 mm的打孔器打取菌饼，在距PDA平板中央2.5 cm的4点对称放置放线菌菌饼，待放线菌培养3 d后，在平板中央接病原菌菌饼，以只接病原菌为对照，每个处理3个重复；于28℃温箱培养5～7 d后，观察抑菌带，并测量其大小，计算抑菌带平均值及抑菌率，初步筛选出对病原菌具有拮抗作用的菌株。

抑菌率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径]×100%

1.2.4 拮抗放线菌的复筛

将初选获得的放线菌单菌落转接于高氏一号培养基上培养5～7 d后，用直径5 mm的打孔器打取菌饼5-6个，接入装有制备100 mL大豆酵母培养基的三角瓶中，在28℃，150 r/min 条件下振荡培养3d，发酵液在6000 r/min离心15 min，取上清液，分别用直径 0.45 μm 、0.22 μm 的细菌滤器除菌后得到无菌发酵液备用；将发酵液以1%的比例混入PDA（约45℃）培养基，于平板中央接种病原菌菌饼。以加入离心后的无菌发酵培养液为对照处理。每个处理3个重复，置于恒温培养箱28℃培养3d后，用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算抑菌率。

1.2.5 拮抗放线菌的形态学鉴定

将复选获得的放线菌菌株接种在高氏一号培养基上，用插片法插片，置于恒温培养箱28℃培养7～10 d后取出，用结晶紫草酸铵染色法染色，在光学显微镜油镜下观察菌株气生菌丝及孢子链特征。

将菌株接种在高氏一号琼脂培养基、PDA、淀粉铵琼脂培养基、蔗糖察氏琼脂培养基、克氏一号琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基以及天门冬素琼脂培养基上，观察记录菌株在各种培养基上的气生菌丝颜色、基内菌丝颜色、可溶性色素的颜色和生长状况[14]。

1.2.6 拮抗放线菌的生理生化鉴定

对菌株进行明胶液化、淀粉水解、纤维素分解、牛奶的凝固与胨化、碳源利用、氮源利用、硫化氢产生试验，测定其生理生化特性[15]。

1.2.7 拮抗放线菌的分子鉴定

利用通用引物27F：5，-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3，，1492r：5，-GGTTACCTTG TTACGACTT-3，对菌株16S rDNA序列进行PCR扩增。反应体系（25 μL）：模板DNA 2.0 μL，2×Taq PCR Mix 12.0 μL，引物 27F/1492r (10.0 μmol/mL)各1.0 μL，ddH2O 9.0 μL。PCR 反应程序：94℃预变性5 min，95℃变性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，32个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外灯下检测扩增产物的有效性。检测到合适的条带后，将其所对应的原始扩增产物（未纯化）100 μL寄往生工生物工程（上海）有限公司测序。所得序列提交GenBank数据库，利用 BLAST 程序与GenBank已登记的基因序列进行同源性比较，选取目标序列及其同源性高的序列，采用MEGA.6软件的邻接法（Neighbour-Joining）构建进化树[16]。

2 结果

2.1 放线菌的分离及拮抗放线菌菌株的初筛

试验从烟田根际土壤样品中分离纯化得到108个放线菌单菌落。平板对峙培养法测定结果表明，对烟草疫霉具有抑菌活性的有19株；对瓜果腐霉具有抑菌活性的有15株；对尖孢镰刀菌具有抑菌活性的有8株。其中，5株放线菌SA20、SA30、SA57、SA74、SA77对烟草疫霉抑菌带≥10 mm，抑菌率≥60%；6株放线菌SA18、SA20、SA27、SA51、SA57、SA74对瓜果腐霉抑菌带≥5 mm，抑菌率≥50%；2株放线菌SA17、SA74 对尖孢镰刀菌抑菌带≥10 mm，抑菌率大于50%（表1、图1）。

表1 拮抗放线菌对烟草病原真菌的拮抗作用Tab.1 Antagonistic effect of antagonistic actinomyces against pathogenic fungus

图1 菌株SA74对病原真菌的拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of strain SA74 against pathogenic fungus

2.2 拮抗放线菌发酵液抑菌活性测定

试验结果表明，菌株SA74、SA57对烟草疫霉和瓜果腐霉的抑菌率均大于70%；且菌株SA74对尖孢镰刀菌的抑菌率也大于50%（表2）。

表2 拮抗放线菌发酵液对病原真菌的拮抗作用Tab.2 Antagonistic effect of antagonistic actinomyces against pathogenic fungus

2.3 菌株SA74的鉴定

2.3.1 形态学鉴定

菌株SA74在高氏一号培养基上基内菌丝红色，疏松、多分枝；气生菌丝乳白色。光学显微镜下观察孢子丝螺旋形、略弯曲；孢子短杆状；孢囊间生或顶生，椭圆形至近圆形；可溶性色素橙红色。在淀粉铵琼脂培养基上基内菌丝紫红色，气生菌丝白色，可溶性色素淡黄色；在克氏一号琼脂培养基上基内菌丝橘红色，气生菌丝白色，无可溶性色素；在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上基内菌丝深红色，气生菌丝白色至橘粉色，可溶性色素浅黄色；在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上基内菌丝橘黄色，无气生菌丝，无可溶性色素；在天门冬素琼脂培养基上基内菌丝红色，气生菌丝白色，可溶性色素浅黄色；在蔗糖察氏琼脂培养基上基内菌丝橘红色，无气生菌丝，无可溶性色素（图2）。

图2 菌株SA74的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of strain SA74

2.3.2 生理生化鉴定

菌株SA74为革兰氏阳性菌；能使明胶液化，说明可产生蛋白酶；可分解利用纤维素且生长良好，表明可产生纤维素酶；淀粉水解能力较强；可产生硫化氢；不能使牛奶凝固和胨化（图3）。碳氮源利用情况见表3。

表3 菌株SA74碳氮源利用测定Tab.3 Carbon and nitrogen source utilization of strain SA74

通过对菌株SA74的形态、培养特征和生理生化特性进行试验观察，初步将其鉴定为链霉菌轮生Verticillatus类群。

图3 菌株SA74的生理生化反应Fig.3 Physiological and biochemical reaction of strain SA74

2.3.3 分子鉴定

菌株SA74的16S rDNA序列提交至GenBank数据库，所得基因登录号为KU870786。将菌株SA74及其同源性高的以及相近种属的其他放线菌16S rDNA 序列比对后，利用MEGA.6软件构建进化树（图4）。结果表明菌株SA74的16S rDNA 序列与GenBank 登录号为AY999774（Streptomyces aureoverticillatus）等序列同源性大于98%。

图4 菌株SA74 16Sr DNA基因序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain SA74 based on 16Sr DNA gene sequence

根据形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将SA74菌株鉴定为金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）。依据链霉菌鉴定手册，其分类地位属放线菌门、放线菌纲、放线菌目、链霉菌属、金黄垂直（回旋）链霉菌。

3 结论与讨论

烟草根际土壤中存在着丰富的拮抗放线菌，由于分离方法的局限及有些放线菌不宜在人工培养基上生长等原因，土壤中还有很多未被发现的拮抗放线菌。本试验从烟田根际土壤中分离纯化得到108个放线菌单菌落，其中22株对瓜果腐霉、烟草疫霉、尖孢镰刀菌的一种有拮抗作用，并筛选出抑菌率均大于50 %的菌株SA74。依据SA74菌株的形态特征及在不同培养基上的培养特征，以及明胶液化、淀粉水解、纤维素分解、碳氮源利用等生理生化指标，将其初步鉴定为链霉菌轮生Verticillatus类群。随后通过形态特征观察和生理生化特性测定，结合16S rDNA序列分析，将菌株SA74鉴定为金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）。

王兰英等[17]发现金黄垂直链霉菌HN6对香蕉有明显的防病促生作用。本试验发现金黄垂直链霉菌对烟草土传病原真菌具有较强抑制效果，其发酵滤液对烟草疫霉的抑制率达73.68%，表明发酵滤液中含有抗菌活性成分。利用金黄垂直链霉菌对植物病害进行生物防治的报道甚少，该菌株的田间防治效果与活性产物分析等有待探究。