基于烟茄嫁接的低烟碱烟草烟叶化学成分变化

任梦娟，史宏志，顿松阳，杨惠娟，李洪亮

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州 450002；2 河南省烟草公司许昌市公司襄城县分公司，河南许昌 461700

生物碱是烟草属（Nicotiana）植物的重要化学成分，其中烟碱是普通烟草属最主要的生物碱，约占总生物碱的90%以上[1]。烟叶在燃吸过程中释放的烟碱通过血液进入脑细胞，使人产生生理反应，因此，被认为是烟叶中主要的活性成分，不仅影响烟叶的劲头，也是使人产生致瘾性的主要成分[2-3]。Benowitz等于1994年首先提出把烟叶烟碱含量降低到使人致瘾的临界值以下可有效减少吸烟者对烟草的依赖性的理念[4]。美国食品和药物管理局宣布，正考虑强制降低可燃香烟中的烟碱含量至不使人致瘾的水平[5]。世界卫生组织为了降低吸烟率，建议将卷烟烟丝中的烟碱含量降至0.4mg/g以下[6]，烟碱含量在0.2至0.3mg/g之间，低于维持上瘾所需的阈值[4]。因此，低烟碱烟叶生产技术的可行性和对烟叶品质及消费者感受的影响成为近几年国际烟草界的研究热点。烟叶的烟碱含量从根本上来说受遗传因素控制，但也受到生态、农艺等措施的强烈影响。目前降低烟叶烟碱含量的技术手段包括常规育种、化学和农艺调控、遗传工程及工业方法等。其中常规育种降低烟碱含量的潜力较小；化学和农艺调控对降低烟叶烟碱含量的幅度十分有限，而且烟碱含量的降低往往伴随着烟叶质量和可用性的显著下降；Legg等[7]曾于上世纪60年代育成了基因型为双隐性的低烟碱品系LAB21，烟碱含量可低至0.3mg/g，其烟叶化学成分与常规的正常烟碱含量烟叶相比发生一定的变化[8-9]，；通过分子手段抑制或敲出烟碱合成的关键基因可有效降低烟碱合成，使烟叶烟碱含量降至接近零的水平，但鉴于其对品质的影响和转基因烟草应用的限制，难以在实际生产中应用[10-12]；通过工业处理如超临界萃取可将烟叶烟碱含量降低至极低水平，但也伴随有香气成分减少等不利影响[13]。

嫁接栽培技术已被广泛应用于瓜果、蔬菜种植上，能够提高产量、改善品质、提高植物抗性、促进养分吸收等[14-15]。嫁接可延缓烟草青枯病的发生，降低发病率和病情指数，提高烟株的产量、产值和均价[16]。早在1942年Dawson证明了烟草烟碱的合成部位位于根部[17]，以烟草为接穗嫁接到茄子上的嫁接苗青枯病的抗性明显提高[18]。但以生产可调制的低烟碱烟叶为目的，以及其对烟叶化学组成变化的影响尚无研究报道。本课题组于2017年以烤烟为接穗，同科的茄子为砧木，成功探索了烟茄种间嫁接技术，并对烟株生长发育过程中农艺性状和鲜烟叶及烤后烟叶化学成分进行了测定，以明确烟茄嫁接生产无烟碱或低烟碱烟叶和嫁接后通过培土诱发接穗产生不定根进而调控烟碱含量的可行性，分析无烟碱或低烟碱烟叶化学成分变化，并对进一步研究对烟叶质量和可用性的影响提供技术和原料支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

本试验于2017年在河南省许昌市襄城县王洛镇王洛烟站，试验材料：以青皮茄子（Solanum melongenaL.）为砧木、烤烟云烟87为接穗，采用盆栽试验。土壤类型：沙壤土，土和烟草专用育苗基质按1∶1重量均匀混合，每盆装土10kg。供试肥料为烟草育苗专用营养液，氮：磷：钾为2∶1∶2。

1.2 试验设计与方法

采用嫁接剪法，选择长有5～6片真叶且茎部没有木质化的烟苗和茄子苗进行嫁接，利用嫁接剪剪下接穗，取烟草顶端2叶一心或3叶一心作为接穗，砧木距茄子苗根部5cm左右剪切，然后将接穗插入砧木切口中，用拇指和食指轻轻压平，最后用嫁接夹固定。每个处理组合嫁接40株，嫁接苗进行避光保温保湿，前3d相对湿度90%左右，之后相对湿度80%左右，3 d之后见光，7 d后进行正常管理，15 d后去掉嫁接夹。试验嫁接组合：云烟87/云烟87、云烟87/茄子。试验嫁接苗6月9日移栽，8月8日打顶，嫁接35d后，选10株长势一致的烟茄嫁接组合进行培土，培土高度超过嫁接口5cm，使烟株茎秆产生不定根。

试验采用盆栽方式，共设3个处理，处理1：接穗与砧木都为云烟87，用“烟/烟”表示；处理2：云烟87为接穗，茄子为砧木不进行培土，用“烟/茄不培土”表示；处理3：云烟87为接穗，茄子为砧木并对烟株进行培土且培土高度高于嫁接口5 cm，用“烟/茄培土”表示。每个处理选择10株，3次重复，共90株嫁接烟株。

鲜烟样（杀青样）：分别在嫁接后65d、80d，取各处理中部叶（第12片叶），待烘箱温度至105℃时，将烟叶放入烘箱杀青15min左右，然后50℃烘干，经研磨后过60目筛用于化学成分测定。

烤后样：烟叶正常成熟采收，各处理选取中部（第7～14叶位）、上部（第15～20叶位），编竿后挂牌标记，采用三段式烘烤工艺烘烤。50℃烘干、研磨，过60目筛，用于化学成分测定。

1.3 测试项目和方法

1.3.1 农艺性状测定

每个处理分别在嫁接后50d、65d、80d选择5 株有代表性的烟株，测量其株高、茎围、节距、叶片数及最大叶长和叶宽。

1.3.2 鲜烟叶色素的测定

分别在嫁接后65d、80d选取烟株中部叶（第12片叶），剔除主脉和第一支脉，用剪刀剪成1mm×1mm的小块，用分析天平秤取样品约0.2g，放入容量瓶内，用95%的乙醇定容至25mL，放入黑暗处浸提24h至叶片完全变成白色，然后以95%的乙醇为空白，用分光光度计分别测定提取液在470nm, 649nm和665nm处的吸光度，根据Arnon法计算各类色素的含量。每个处理做3次重复。

计算公式[19]：

叶绿素a：Ca(mg/L)=13.95A665-6.88A649

叶绿素b：Cb(mg/L)=24.96A649-7.32A665

类胡萝卜素：Cx.c(mg/L)=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

色素含量（mg/g）= 浓度（mg/L）×提取液总量（L）/样重（g）

总叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素a+叶绿素b

1.3.3 鲜烟叶及烤后烟生物碱的测定

在碱性条件下，用甲基叔丁基醚 (MTBE) 提取200 mg 样品的生物碱，以正十六烷为内标，通过气相色谱 - 氢火焰离子化检测器 (GC-FID) (Agilent 7890A, Agilent Technologies, USA) 定量检测烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱4 种生物碱的含量。

1.3.4 烤后烟及鲜烟叶常规化学成分测定

总糖：参照YC/T159—2002；还原糖：参照YC/T216—2007；蛋白质：参照YC/T249—2008；淀粉：YC/T216—2013；总氮：参照YC/T161—2002。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2010和SSPS17.0软件进行数据统计分析。采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 烟茄嫁接对烟株农艺性状的影响

如表 1所示。嫁接后50d，各处理的株高、茎围、节距、叶片数、最大叶长、叶宽差异不显著，且叶片数、最大叶长、叶宽均以烟/茄不培土处理最大，烟/茄不培土与烟/茄培土处理的茎围均高于对照烟/烟处理。嫁接后65d，各处理叶片数、最大叶长和叶宽均存在显著性差异，各处理间株高、茎围、节距差异不显著。嫁接后80d各处理间茎围、最大叶长和叶宽均存在显著性差异，以烟/茄培土处理最大，对照烟/烟处理最小，各处理株高、节距、叶片数差异不显著。结果表明，烟茄嫁接后烟株形态特征、长势长相未发生显著改变，表明形态建成受根系影响较小。

表1 烟茄嫁接对烤烟烟株农艺性状的影响Tab.1 Effect of tobacco and eggplant grafting on agronomic characters of flue-cured tobacco

2.2 烟茄嫁接对鲜烟叶色素含量的影响

如表 2所示。嫁接后65d，各处理叶绿素a和类胡萝卜素含量差异不显著，烟/茄不培土和烟/茄培土的叶绿素b和叶绿素总量均显著高于烟/烟，其中叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总量以烟/茄不培土处理最高，烟/烟的类胡萝卜素含量最高。嫁接后80d，各处理叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量以及叶绿素总量均存在显著性差异，其中叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总量均以烟/茄不培土处理最高，且与对照烟/烟处理存在显著性差异，类胡萝卜素含量以对照烟/烟嫁接烟株最高，且与烟/茄不培土、烟/茄培土处理存在显著性差异，烟/茄不培土、烟/茄培土之间差异不显著，说明烟茄嫁接条件下，烟株后期叶片叶绿素含量下降缓慢，但类胡萝卜素含量降低明显，叶绿素与类胡萝卜素比值增加。外观表现为嫁接烟株烟叶成熟落黄显著滞后于对照烟株。

表2 烟茄嫁接对鲜烟叶色素含量的影响Tab.2 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of pigment in fresh tobacco

2.3 烟茄嫁接对烟叶生物碱含量的影响

2.3.1 烟茄嫁接对鲜烟叶生物碱含量的影响

如表3所示。嫁接后65d，各处理的烟碱、假木贼碱、生物碱总量均存在显著性差异，烟/茄不培土和烟/茄培土烟碱、总生物碱含量显著低于烟/烟，烟/茄不培土的烟碱和总生物碱含量分别为0.0834%、0.0883%，烟/茄不培土与烟/茄培土处理烟碱占总生物碱的比例较烟/烟有所增加；烟/茄不培土与烟/茄培土处理的假木贼碱含量差异不显著，均显著低于烟/烟处理，占总生物碱的比例分别高达5.55%、3.28%，烟/茄不培土和烟/茄培土的生物碱总量分别比烟/烟降低83.70%、72.97%。嫁接后80d，各处理烟碱、假木贼碱含量及生物碱总量存在显著性差异，烟/烟处理较高，烟/茄不培土处理较低，低至0.0804%，其中除假木贼碱外，生物碱含量的变化与嫁接后65d变化规律一致，烟/茄不培土与烟/茄培土处理的烟碱和假木贼碱占总生物碱的比例有所增加，烟/茄不培土和烟/茄培土的生物碱总量分别比烟/烟降低88.11%、78.06%。综上所述，烟/茄培土与烟/茄不培土处理生物碱含量偏低，以烟/茄不培土处理最低。表明，烟茄嫁接可显著降低烟叶生物碱含量，增加假木贼碱占总生物碱的比例。

表3 烟茄嫁接对鲜烟叶生物碱含量的影响Tab.3 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in fresh tobacco

2.3.2 烟茄嫁接对烤后烟叶生物碱含量的影响

由表4知。上部叶，各处理的烟碱、假木贼碱、降烟碱、新烟草碱含量存在显著性差异，烟/茄不培土和烟/茄培土处理处理的烟碱、假木贼碱、新烟草碱、降烟碱的含量明显低于烟/烟，烟/茄不培土的烟碱含量低至0.0999%，比烟/烟降低94.81%，烟/茄培土比烟/烟降低85.75%；烟茄嫁接处理的烟碱占总生物碱的比例大幅下降，降烟碱、假木贼碱、新烟草碱占总生物碱的比例大幅升高；烟/茄不培土和烟/茄培土的生物碱总量均显著低于烟/烟，分别比对照降低93.56%、83.90%。中部叶，各处理生物碱含量及总生物碱含量变化规律与上部叶基本一致，烟/茄不培土处理的烟碱、降烟碱、新烟草碱含量最低，烟/茄不培土的烟碱含量为0.1068%，比烟/烟降低94.50%，烟/茄培土比烟/烟降低83.50%，烟/茄不培土和烟/茄培土的总生物碱分别比对照降低94.44%、82.17%。结果表明，烟茄嫁接可显著降低烟叶生物碱含量，降低烟碱占总生物碱的比例，升高降烟碱、假木贼碱、新烟草碱占总生物碱的比例。

表4 烟茄嫁接对烤后烟烟叶生物碱含量的影响Tab.4 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in flue-cured tobacco

2.4 烟茄嫁接对烟叶常规化学成分的影响

2.4.1 烟茄嫁接对鲜烟叶常规化学成分含量的影响

如表5所示。嫁接后65d，不同处理总氮、总糖、还原糖、烟碱含量差异达显著水平，烟/茄培土与烟/茄不培土处理间的总氮含量差异不显著，且均显著高于烟/烟，烟/茄培土最大；烟/茄培土与烟/茄不培土处理的总糖、还原糖和烟碱含量显著低于烟/烟，烟/茄不培土的烟碱含量低至0.09%。嫁接后80d，各处理常规化学成分变化规律与嫁接后65d一致，烟茄嫁接处理的总氮含量显著增加，总糖、还原糖和烟碱含量显著降低，烟/茄不培土的烟碱含量低至0.08%。结果表明，烟茄嫁接后烟叶总氮、总糖、还原糖、烟碱等含量受根系影响较大。

2.4.2 烟茄嫁接对烤后烟叶常规化学成分的影响

如表6所示。上部叶，烟/茄培土和烟/茄不培土处理烟叶蛋白质、总氮、淀粉含量均显著高于烟/烟，且烟/茄培土和烟/茄不培土两处理间无显著性差异，烟碱、总糖、还原糖含量显著低于烟/烟。烟/茄不培土与烟/烟相比，淀粉增加79.02%，烟碱含量减少95%。中部叶，各处理烟叶常规化学成分含量变化规律与上部叶一致，烟/茄不培土与烟/烟相比，淀粉增加55.13%，烟碱含量减少95%。表明通过嫁接生产的低烟碱烟草蛋白质、总氮和淀粉含量较高，总糖和还原糖含量较低。

表5 烟茄嫁接对鲜烟叶常规化学成分的影响Tab.5 Effect of tobacco and eggplant grafting on chemical composition in fresh tobacco

表6 烟茄嫁接对烤后烟常规化学成分的影响Tab.6 Effect of tobacco and eggplant grafting on chemical composition in flue-curedtobacco

3 讨论

烟碱含量高低对烟叶的劲头、香味和刺激性有显著影响[1]。通常情况下，烤烟烟碱含量为1.5%～3.5%，在烟叶生产过程中，可通过移栽期、种植密度、打顶和抹杈及留叶数、生长调节物质、施肥等[20-21]栽培措施直接或间接调控烟碱的含量，但会对烟草的生长发育、生理生化代谢、烟叶的化学成分和品质造成影响，且烟碱降低幅度较小。烟碱主要在根中合成，因而通过嫁接技术对烟草进行换根，可显著降低烟碱生物合成，生产无烟碱或极低烟碱水平的烟叶。研究结果表明，嫁接烟草农艺性状、长势长相和生育特性与对照相近，但烟茄嫁接对烟叶后期色素含量和化学成分含量有一定影响，与对照相比表现为叶绿素、蛋白质含量偏高，糖分含量下降，这可能与碳氮分配和碳氮代谢的变化有关，烟茄嫁接后氨基酸不再进入生物碱合成途径，可能更多地用于蛋白质的合成或其它代谢途径。通过观察可知，嫁接烟叶后期叶色较深，成熟落黄相对较慢，烟/茄不培土处理淀粉含量偏高，可能是由烟叶成熟度不够导致的，Legg and Collins[7]通过遗传育种方法获得的低生物碱品系也存在成熟延迟、成熟不良问题。本试验中的不培土的烟茄嫁接烟叶仍然检测到了低含量的烟碱，表明其仍有较弱的烟碱合成能力，这些微量烟碱是来自于茄子或是嫁接部位有待进一步研究。通过培土诱发了接穗基部产生不定根，烟叶烟碱含量较不培土的嫁接烟显著增加，表明接穗不定根具有烟碱合成能力，因此通过培土等措施控制不定根的产生，可有效控制烟碱合成，为生产上生产不同烟碱含量烟叶提供技术上的可行性。此外，嫁接烟叶的假木贼碱含量没有与烟碱含量同步下降，其占总生物碱含量的比例显著上升，这可能是因为假木贼碱在叶片中有一定的合成能力[22]。嫁接烟叶烟碱含量降至极低的水平，其他常规化学成分相对差异较小，因此实现了对烟碱含量的选择性降低，所获得的极低烟碱含量烟叶对进一步研究烟碱在卷烟化学组成中的作用和对感官质量的影响有重要价值。以茄子为砧木嫁接烟苗不仅成活率高，而且烟草接穗正常生长，能大幅降低烟叶烟碱含量，但嫁接技术技术性较强，对茄子和烟苗素质要求较高，用工量相对较大，本试验嫁接成活率为80%左右。随着嫁接技术的优化，嫁接效率和嫁接烟苗成活率会进一步提高。

4 结论

烟茄嫁接烟株植物学特征和农艺性状未显著改变，烟叶烟碱含量降至极低水平，通过培土诱发不定根产生可以有效调控烟茄嫁接烟叶的烟碱含量。烟茄嫁接烟株叶绿素含量后期降低缓慢，成熟较慢，烟叶其他常规化学成分有所改变，表现为蛋白质、淀粉、总氮含量增加，总糖、还原糖含量降低。本研究为通过农业措施选择性大幅降低烟叶烟碱含量提供了技术支持。