厌氧消化污泥体系的DNA-稳定同位素探针标记条件研究

赵宇莎， 郑 丹， 于 琪， 苟 敏， 汤岳琴

(1.四川大学 建筑与环境学院， 成都 610065； 2. 农业农村部沼气科学研究所， 成都 610041； 3.中原康达环保产业有限公司， 郑州 450000)

厌氧消化能有效地促进能源与环境的协调发展，一直备受关注。该过程通常需要不同微生物群落(发酵细菌，产氢产乙酸菌和产甲烷菌)的参与协作，才能实现甲烷的生产[1]。研究证实，有更多功能与特性未知的未培养微生物参与了厌氧消化过程，产甲烷机制比预期的更加复杂[2]。因此，鉴定厌氧消化体系中的微生物多样性，有助于深入理解产甲烷机制并指导工艺优化调控。宏基因组学是近20年新兴的科学领域，它避开微生物的分离培养过程，直接从基因层面原位研究微生物的多样性，可最大限度地识别环境微生物的群落信息[3]。基于宏基因组的分子生物学技术(如DGGE，16S rRNA基因克隆文库，T-RFLP等)的发展，已经成为分析厌氧消化过程优势微生物的重要平台[4]。但这些传统方法鉴定到的优势菌群往往并非是“真正”的功能微生物。

DNA稳定同位素探针(DNA stable-isotope probing, DNA-SIP)是一种新兴的分子生态学技术，可用于甄别复杂环境中参与特殊代谢功能的微生物。其基本原理为：环境样品经稳定同位素标记的底物(以13C为主)培养后，微生物利用13C-底物生长繁殖合成13C-DNA，通过浮力密度差异将13C-DNA与12C-DNA分离，进一步对13C-DNA进行分析即可获得功能微生物的信息。由于DNA-SIP仅以来源于底物利用菌的13C-DNA为研究对象，因此极大地降低了环境微生物群落的复杂性，从而将底物代谢过程与微生物群落组成直接相联系[5]。鉴于DNA-SIP技术的优势，现已被应用于不同环境中各类微生物功能菌的鉴定(如甲基互营，生物降解，碳氮循环等过程)，但其在厌氧消化过程中的应用相对较少[6]。

此外，DNA-SIP存在13C-DNA回收量小、时间长、容易交叉标记等缺陷，因此，探索合适的标记及离心条件并获得足够的13C-DNA是成功富集功能微生物的关键[6]。本研究以13C-葡萄糖为底物，考察了不同条件对厌氧消化污泥中葡萄糖利用菌的标记效果，旨在为鉴定真正的厌氧消化功能群提供基础，进而促进对厌氧产甲烷机制的理解。

1 材料与方法

1.1 污泥来源

用于稳定同位素标记的污泥来自本实验的纤维素厌氧消化反应器。该完全混合型反应器总体积3 L，工作体积2 L，纤维素进料负荷为1 g·L-1d-1，在53℃，低速搅拌(85 rpm)条件下连续稳定运行212 d。

1.2 试剂

主要试剂如13C-葡萄糖(13C，99%)，CsCl，CTAB购于sigma公司(美国)。

1.3 污泥样品的标记及分析

1.3.1 标记样品的培养及采样

取30 mL厌氧消化污泥于50 mL厌氧瓶中，通入氮气置换空气后，立即采用丁基胶塞和铝盖密封，并放置于摇床中饿养至污泥停止产气。随后将葡萄糖溶于灭菌水后采用无菌注射器投入厌氧瓶，同时补充少量微量元素溶液，于53℃和150 rpm条件下培养并取样分析。底物添加及取样操作均在厌氧手套箱(Gene Science AG300，美国)中进行。所有处理均设置两个平行样，并分别以12C-葡萄糖作为对照。其中，使用的微量元素溶液组分如下(g·L-1)：FeCl3·6H2O, 1.35；MnCl2·4H2O, 0.1；CaCl2·2 H2O，0.1；ZnCl2，0.1；CuCl2·2H2O，0.025；H3BO3，0.01；Na2MoO4·2H2O，0.024；NaCl，1.0；Na2SeO3·5 H2O，0.026；次氮基三乙酸 (NTA)，12.8。

1.3.2 标记过程的气体和样品收集

定期采用10 mL无菌注射器测定产气量。污泥品样定期取样后，于12000 rpm，4℃离心10 min后，污泥沉淀和适量体积PBS缓冲溶液混合震荡，于12000 rpm，4℃离心10 min，反复清洗2～3次后，去除上清液，污泥沉淀保存于-80℃，用于后续的PCR定量分析。

1.3.3 超高速密度梯度离心分离

利用常规CTAB法提取污泥的总DNA。取2.5 μg DNA，与4.8 mL CsCl溶液，1.2 mL Gradient Buffer(GB缓冲液)混匀, 采用10 mL无菌注射器将混合液移至6 ml超高速离心管中，于超高速离心机(Beckman Coulter, OptimaTML-80 XP, 美国)离心形成浮力密度梯度区带。离心后使用软管连接精密注射泵(Harvard Apparatus Pump 11 Pico Plus，美国)与离心管，利用无菌水的水压收集各层样品，并采用折光仪(Reichert AR200，美国)测定各层级折光率。折光率与密度的换算公式如下：

n=0.0796ρ+1.2649

(1)

式中：n为液体折光率；ρ为液体密度，g·mL-1。

1.3.4 荧光定量PCR分析

对各层样品的16S rDNA基因含量(拷贝数)进行荧光定量PCR分析。反应体系总体积为20 μl，包括：10 μM引物Eu518F及Eu27F各0.8 μl，SYBR染液10 μl，DNA 2.0 μl，灭菌水6.4 μl。PCR反应条件如下：95℃，预变性30 s；95℃，变性10 s，50℃，退火5 s，72℃，延伸40 s，共40个循环；融解95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；冷却37℃ 30 s。以16S rDNA基因的丰度(每层拷贝数与各层级拷贝数总和的比值)为纵坐标，浮力密度为横坐标，可得16S rDNA基因在不同浮力密度中的分布规律图。

1.4 DNA-SIP标记条件的优化

1.4.1 离心转速对DNA-SIP标记效果的影响

取底物投加量为30 mg葡萄糖，标记时间为4天的样品, 分别在45400 rpm和50300 rpm的转速下于20℃离心40 h，考察超高速离心转速对标记效果的影响。

1.4.2 底物投加量对DNA-SIP标记效果的影响

分别投加总量为30 mg和60 mg的葡萄糖，考察底物投机量对标记效果的影响。30 mg葡萄糖一次性投加，停止产气时(4 d)取样。60 mg葡萄糖于第0和6天分别投加30 mg，取样时间为第11天。

1.4.3 污泥固含量对DNA-SIP标记效果的影响

取若干消化污泥，在20℃，14000 rpm条件离心10 min。利用上清液稀释使得污泥固含量分别为0.1%，0.2%，0.4%，2.1% (w/w)。分批投加总量为100 mg的葡萄糖进行标记培养，即于第0，4和8天分别投加33.3 mg，取样时间为第8和12天(取样时底物投加总量分别为66.6 mg和100 mg)。样品经20℃，45400 rpm，40 h超离速离心分层后，考察污泥固含量对标记效果的影响。

2 结果

2.1 离心条件优化

实验室前期小试发现:经13C-葡萄糖标记的污泥中的12C-DNA与13C-DNA的浮力密度分别为1.70 g·mL-1及1.72～1.74 g·mL-1左右(数据未显示)。因此，本研究考察了文献报道常用的两个离心转速(50300 rpm和45400 rpm)对污泥样品的DNA-SIP标记效果。表1显示：不同转速下形成的CsCl介质中相邻梯度区带的浮力密度差有较大差异。由表1可知转速为45400 rpm形成的浮力密度差较小。为确保两种DNA离心后相隔一个区带，能被有效分离，故后续离心条件设为20℃，45400 rpm，40 h。

表1 不同转速条件下微生物DNA的分离效果 (g·mL-1)

2.2 底物投加量优化

分别向污泥中投加总量为30 mg和60 mg的葡萄糖，产气量如图1所示。由图可知：所有样品的产气量均在第1天迅速升高，微生物每消耗完30 mg葡萄糖大约需4～6 d，随后逐渐停止产气。且12C-葡萄糖与13C-葡萄糖的产气趋势及产气量基本吻合，可作为对照进行后续实验。同时，根据产气结果，将30 mg和60 mg葡萄糖标记样品的取样时间分别设置为第4天和第11天。

图1 葡萄糖总量30 mg产气情况

图2 葡萄糖总量60 mg产气情况

标记后的污泥样品经超高速离心分层以后，利用定量PCR检测每层的16S rDNA基因含量。获得16S rDNA基因丰度在不同浮力密度中的分布规律，如图3和图4所示。由图可知，在轻密度层1.69～1.71 g·mL-1的范围内，所有样品均出现最高丰度，这表明污泥样品12C-DNA在1.70 g·m-1左右的密度层被富集。在重密度层1.72～1.74 g·mL-1的范围内，投加有30 mg13C-葡萄糖的污泥样品仅检测到较低的16S rDNA基因拷贝数，表明该条件下13C-DNA富集程度不高。投加有60 mg13C-葡萄糖的样品13C-DNA丰度明显提高，两个平行样品的丰度分别达到了10.41%和6.05%，而12C-葡萄糖对照样品中的丰度仅为1.0%，这表明60 mg的13C-葡萄糖可以富集到更多的13C-DNA，功能菌能被有效标记。但图3和图4也显示，在1.72～1.74 g·mL-1前后的密度层中也能检测到一定数量的13C-DNA。因此，为了为提高重密度层中13C-DNA的丰度，减少非目标微生物的影响，后续实验应进一步加大底物投加量。

图3 葡萄糖总量30 mg，培养时间4 d对DNA-SIP标记效果的影响

图4 葡萄糖总量60 mg，培养时间11 d对DNA-SIP标记效果的影响

2.3 污泥固含量优化

污泥固含量对DNA-SIP标记效果的影响如图5～图8所示。由图可知：在1.72～1.74 g·mL-1的密度范围内，污泥固含量为0.1%，0.2%和0.4%(w/w)的所有样品的13C-DNA拷贝数明显高于2.1%的样品。

当底物投加量为66.6 mg时(标记8天的样品)，13C-DNA主要存在于1.72 g·mL-1左右的密度层，且不同污泥固含量样品的13C-DNA丰度差异较大。污泥固含量为0.1%，0.2%，0.4%和2.1%(w/w)的样品中，13C-DNA丰度分别约为16.3%，10%，10%和8.2%。这表示在该底物浓度下污泥固含量越低，13C-DNA富集程度越高。而在更“重”的密度层1.74 g·mL-1附近，各污泥固含量的13C-DNA丰度均低于5%。

当底物投加量为100 mg时(标记12 d的样品)，与第8天的标记样品相比，所有污泥样品在1.72～1.74 g·mL-1密度层的13C-DNA丰度均有明显提升。尤其在1.74 g·mL-1的密度层，除污泥固含量为2.1%的样品外，其它样品的13C-DNA丰度均从第8天的低于5%提升至15%左右。上述结果表明：当底物投加量从66.6 mg增至100 mg时，可有效提高13C-DNA在重密度层的丰度，显示出更好的标记效果。此外，2.1%固含量的污泥样品中的13C-DNA拷贝数在1.72～1.74 g·mL-1密度层仍然最低，表明即使投加更高浓度的底物，相对较低的污泥固含量仍更有利于13C-DNA的富集。但在污泥固含量为0.4%，0.2%，0.1%的样品中，13C-DNA在1.74 g·mL-1密度层的丰度并未随着污泥固含量的减少而增大(分别为16.3%，14.2%和14%)。这可能是底物投加量已超过污泥中微生物的代谢水平，大部分功能微生物已被标记，若继续增加底物投加量难以提高样品的标记效果。

图5 污泥固含量2.1%(w/w)对DNA-SIP标记效果的影响

图6 污泥固含量0.4%(w/w)对DNA-SIP标记效果的影响

图7 污泥固含量0.2%(w/w)对DNA-SIP标记效果的影响

图8 污泥固含量0.1%(w/w)对DNA-SIP标记效果的影响

3 讨论

DNA-SIP具有鉴定不同环境中“真正”功能微生物的优势。合适的标记及离心条件可以避免底物的二级利用，确保DNA的标记及富集效果，是决定该技术成功的关键。但标记效果受到多因素的影响：如环境样品性质、微生物种类、底物结构、标记时间、离心转速及时间等，DNA-SIP的培养条件及离心条件难以标准化[6]。鉴于利用DNA-SIP识别厌氧消化功能微生物的研究相对较少，本研究考察了不同条件(离心转速、底物投加量和污泥固含量)对厌氧污泥中葡萄糖利用菌的标记效果的影响。

利用超高速密度梯度离心技术可有效地将环境总DNA中的12C-DNA与13C-DNA有效分离。本研究发现45400 rpm的转速比 50300 rpm有更好的13C-DNA富集效果。据报道，DNA在CsCl介质中的浮力密度与微生物的GC含量成正比[7]。但无论哪种转速条件，重浮力密度层仍然同时含有12C-DNA与13C-DNA。Lueders[8]等发现，即使采用纯菌的12C-DNA进行超高速离心，重密度层中仍能检测到0.7%的12C-DNA。因此，这说明目标微生物很难100%被标记，DNA-SIP实验必须设计12C底物的对照样品。

研究表明，当13C-DNA丰度接近20%时，更容易从环境样品总DNA中分离出13C-DNA[9]。而13C-DNA的生成伴随着微生物细胞对底物的同化利用，这表明13C-DNA丰度与底物投加量和微生物种群数量(本文为污泥固含量)存在直接联系。底物投加量优化结果显示：在1.72～1.74 g·mL-1的密度范围内，投加30 mg13C-葡萄糖的污泥样品的13C-DNA丰度较低。目前尚无标准方法来确定底物投加量，但底物浓度过低难以标记到目标微生物，因为仅有1/3的底物被微生物用于合成自身物质[10]。此外，加入体系的底物被微生物同化之前会有一个稀释过程，这使得微生物会暂时利用其他碳源或中间代谢产物，这一特性降低了13C-DNA的比例，进一步增加了计算底物投加量的难度[9]。虽然分批投加60 mg13C-葡萄糖可以将13C-DNA丰度提高到10.41%，但仍含有较多的非目标微生物。因此，在后续考察污泥固含量的研究中，将13C-葡萄糖投加量提高到了100 mg，此时污泥中13C-DNA丰度最高可达16.3%。上述结果表明，高的底物投加量有助于提高13C-DNA丰度。但底物投加量过高，一方面会增加DNA-SIP的成本；另一方面会使样品脱离原始状态，群落代谢过程受到影响，产生微生物富集偏差，不符合DNA-SIP原位鉴定的宗旨。因此，在满足13C-DNA的标记效果及分离效果的基础上，采用最少的13C底物是理想的培养实验[11]。污泥固含量研究结果显示：当底物浓度一定时(不高于污泥最高代谢水平)，污泥固含量越低，13C-DNA富集程度越高。该结果进一步证实底物量与微生物种群数量需要有合适的比例，才能获得最高的标记13C-DNA。不同研究报道中的微生物菌群生态位、生理代谢差异极大，因此，非常有必要对这两个因素进行优化。

4 结论

选择合适的标记及离心条件以获得足够的13C-DNA，是利用DNA-SIP技术成功富集功能微生物的关键。本研究以13C-葡萄糖为底物，选取离心转速，底物投加量和污泥固含量3个重要因素，考察了它们对厌氧消化污泥中葡萄糖利用菌的DNA-SIP标记效果的影响。结果显示，相对低的转速、高底物投加量及低污泥固含量可以获得较高的13C-DNA丰度。但底物量不能一味增加，需同时考虑微生物的代谢水平、与环境条件的一致性等因素，在尽量减少成本的基础上以避免微生物的富集偏差。