一种快速批量转Bt基因抗虫棉杂交后代的筛选方法

赵俊侠 ，陈 耕 ，潘转霞 ，郭海莉 ，夏 芝 ，孙振纲 ，朱永红 ，胡晓丽

（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2.稷山县农业局，山西稷山043200）

转基因抗虫棉是指棉花细胞染色体上整合有外源抗虫基因的棉花品种。抗虫基因通常为来源于苏云金芽孢杆菌的Bt基因（Bacillus thuringiensis，苏云金芽孢杆菌）的简称，它是一种革兰氏阳性菌，在地球上分布十分广泛。Bt基因对鳞翅目昆虫有专一的杀伤作用，能产生多种对昆虫有特异活性的杀虫蛋白。棉花抗虫育种历史不长，由于外源基因转化技术的局限，目前所获得的转基因抗虫棉，其遗传基础还较为单一，远不能满足现代棉花生产发展对品种的高要求。在棉花品种选育中，通过不同性状的棉花株系进行杂交，以期获得具有不同亲本所携带的优良性状，并且一定要兼具抗虫特性，即后代材料要携带Bt基因。在转基因抗虫棉杂交后代材料中，由于杂交二代出现分离，后代材料含有大量无效或不可利用的杂交后代。所以，在大量的后代材料中，选择含有外源基因的目标植株是培育转基因抗虫棉的重要步骤。根据NptⅡ基因（卡那霉素标记基因）与Bt抗虫基因紧密连锁的关系[1]，通过对植株抗卡那霉素特性的筛选，来获得带有Bt基因的后代材料。

转基因抗虫棉杂交后代鉴别的常用方法有PCR扩增电泳检测法和田间卡那霉素涂抹鉴定法[2]。PCR扩增电泳是最常用的实验室转基因植株遗传检测方法[3]，但存在诸多缺点，需要实验室和仪器，DNA制备过程复杂繁琐且实验技术要求高，鉴别时，花费且工作量巨大。田间卡那霉素涂抹鉴定[4]，夏天高温作业一株一叶涂抹，工作量大而繁重，受天气环境影响大且因操作的人为差异造成鉴定结果假阳性偏多。因此，把棉花转基因技术和种子发芽技术相结合，设计出本试验的一套技术方法，不同于实验室操作、高效快捷、简便实用的棉花转基因后代植株的检测与筛选方法，以满足在棉花育种生产中，大量群体转基因抗虫棉杂交后代的筛选与鉴定需要。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为以多抗、丰产、高衣分晋棉19为母本，抗虫品系运148为父本杂交组合的F2种子，随机选出100粒备用。

1.2 试验方法

1.2.1 卡那霉素选择试验 种子经硫酸脱绒后，用70%酒精浸泡2 s，然后放入10%～15%H2O2消毒2～4 h，用无菌水冲洗，浸泡于三角瓶中，封口，在20～30℃下经过24 h，待种子萌动后，去种皮接种或直接放入培养后续制备的器皿中培养[5]。条件许可的实验室采取经高温灭菌的培养皿，农户、农场或无实验条件时采用蒸煮过的盘碟等，在其底部铺2层高温灭菌或蒸煮过的纱布或毛巾一层。

将150 mg/L的卡那霉素溶液倒入培养皿或盘碟，盘碟加盘碟为盖，保持水分，光照培养或暗培养均可，培养温度28℃。器皿大小以需检测种子多少为根据准备。培养时间：去种皮接种培养需要2 d[6]，直接放入培养不去种皮接种需要4 d。2 d后，对种子下胚轴伸长观察并对长度进行测量，生长较快的种子，下胚轴伸长达2.3 cm以上，饱满有活力，部分种子则表现为下胚轴略微伸长或仅仅子叶稍微展开，缺乏生机，下胚轴长度不到2.3 cm。

1.2.2 PCR检测对比试验 100粒F2出现分离的杂交后代的种子，用1.2.1所述方法进行筛选鉴别后，提取棉花幼苗叶片DNA并进行PCR扩增电泳。

2 结果与分析

本试验选取100粒F2出现分离的杂交后代种子，测量种子萌发后的下胚轴长度，再提取棉花幼苗叶片DNA进行PCR扩增电泳，进行Bt基因检测。由于有些种子成熟度较差，处理过程中腐烂或没有成苗，共获得64例有效幼苗，下胚轴伸长大约2.3 cm以上的有36株，不到2.3 cm的有28株。结果表明，使用该方法对转基因抗虫棉杂交后代材料筛选与经PCR检测结果一致。因为在导入的外源基因构建中，NptⅡ基因（卡那霉素标记基因）与Bt抗虫基因紧密连锁，因此，含有NptⅡ基因（卡那霉素标记基因）的检测材料会在150 mg/L的卡那霉素基质上生长伸长，伸长的种子含着Bt抗虫基因，反之则不含抗虫基因。

3 结论与讨论

本研究讨论的是以Bt抗虫棉的成熟种质材料作为亲本产生的杂交后代，在推广生产中应用的品种，Bt基因和NptⅡ基因连锁，存在于一条染色体上，在育种中表现为稳定遗传。如李汝忠等[7]用抗虫亲本与非抗虫亲本直接杂交的F1，在田间自然感虫条件下，均表现出高抗棉铃虫性，抗性不分离。该方法还可以用于转基因单株[8-9]的检测。即使出现个别分离现象，在品种育成过程中，会通过抗虫性检测试验排除，因为不管是本研究的试验方法、卡那霉素涂抹、PCR检测等，都是一种对抗虫基因的筛选替代，最终品种的抗虫特性必须通过抗虫性检测。

在培育抗虫棉花品种过程中，李朋波等[10]研究表明，以常规棉和转基因抗虫棉及其杂交、回交后代为材料，对卡那霉素抗性与测虫鉴定结果进行比较。结果表明，二者鉴定结果一致性达96%以上。本研究表明，更好选择和利用杂交组合后代中种质资源，配合育种的计划周期，结合播种时间或南繁安排，将批量的杂交后代种子利用该方法筛选萌发后下胚轴长度2.3 cm以上的种子，可直接开沟播种于试验区域或大田。本试验方法不仅可以更准确地控制假阳性，而且对后代的鉴别大约能提早4～5个月，不但节省了检测成本，缩短了检测时间，使后续其他途径的验证更加具有针对性。因此，本研究的方法更利于在非实验室条件下，对育种中大量棉花转基因后代种子进行快速筛选与鉴定。