奶牛乳房炎中药注射剂的制备

高 翔，韩克光

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

奶牛乳房炎是由于奶牛乳腺组织在挤奶时受到刺激或者由于环境卫生、饲养管理等环节中受微生物感染后引起的一系列炎症反应[1-2]，最终导致产奶量下降、乳汁废弃、病牛被淘汰以及治疗费用的增加。奶牛乳房炎由于发病率高且久治难愈，预防及治疗困难为奶牛养殖业造成了巨大的经济损失，全球每年因奶牛乳房炎带来的经济损失高达300多亿美元。因为相对于欧美发达国家而言，我国奶牛养殖业仍处于较低水平，每年因奶牛乳房炎造成的经济损失达150亿～450亿元[3]。

在乳房炎的治疗方面，抗生素疗法起效快，治愈率高，但长期及大剂量的使用，造成耐药菌株的增加，牛奶中残留大量抗生素，给人类带来严重的安全隐患。张咚咚等[4]对奶牛乳房炎的细菌分离及耐药性分析发现，致病菌对常用抗生素青霉素、头孢曲松、头孢噻肟等药物都产生了不同程度的耐药性。

与抗生素相比，中草药具有耐药性低、体内代谢快、残留小等优点[5]，并且兼具预防与治疗的效果，能够提高机体免疫力。但是传统中药剂型，如散剂、煎剂、灌注剂等，由于用量大、药效低、不易运输、保存期短等缺点，在动物临床应用中局限性大。张玲等[6]选取了6味中药制备成中药散剂，治疗效果良好，提高了产奶量，但是所需散剂剂量大，不易保存，易受潮变质。王金君等[7]选取了10味中药制备成煎剂，对患病奶牛进行灌服，治愈率可达80%以上，说明该煎剂对奶牛乳房炎有较好的治疗效果，但是在制备中时间长、提取温度高，容易造成一些对热敏感的有效成分流失。张振国等[8]选取了7味中药制备成乳房灌注剂，对患病奶牛进行了4 d的乳区灌注，治愈率高达90%，但是在灌注过程中，由于奶牛乳房的倒置结构，药物注入乳池后部分药液流出，乳管易堵塞，导致药物分布不均，影响治疗效果。而中药注射剂的研制弥补了上述中药治疗的缺陷，打破了中药固有的给药模式，其具有起效快、生物利用度高、毒性小、易携带储存等特点。唐静静等[9]制备的金英黄归注射液，薛占永等[10]制备的新型复方蒲公英中药注射液及周绪正等[11]制备的“乳源康注射液”对奶牛乳房炎的治疗均表现出较好的效果。中药注射剂的制备是将中药通过煎煮、蒸馏等步骤对其中有效成分进行提取。但提取液杂质较多，需要进一步提纯精制，在制备过程中如何减少有效成分的损失，提高其稳定性，是研制中药注射剂亟需解决的难题。

本试验通过超声提取法提取和ZTC1+1澄清剂沉淀吸附法纯化制备中药注射剂，依据国家药典对注射液进行一系列的质量及安全性检测，且在符合规定后进一步检验其抑菌消炎效果，从而建立奶牛乳房炎中药注射剂制备方法，为奶牛乳房炎的治疗提供新的手段。

1 材料和方法

1.1 试验材料

乳香、蒲公英、金银花、黄芩等药材购自山西省太谷县医药药材公司。

1.2 试验仪器

超声波清洗器、旋转蒸发仪、循环水式真空泵，4℃冰箱，高效液相色谱仪。

1.3 处方的选择

根据奶牛乳房炎的发病机制，以及在查阅大量文献的基础上发现，蒲公英具有抑菌抗炎、消肿散结的功效[12]；黄芩具有清热解毒、抗菌、提高机体免疫力的功效[13]，在对奶牛乳房炎治疗和预防时，可与蒲公英作为首选药物进行配伍组方[14]；金银花具有消炎、抗菌、抗病毒的功效[15]，能够有效提高蒲公英的治疗效果；乳香具有消炎抗肿，止痛的功效[16]。通过与多位临床兽医及老师的研究，选用上述4味中药材作为制备中药注射剂的处方。

1.4 复方提取液的制备

与传统煎煮法相比，超声提取法对中药有效成分提取率高、时间短、操作简单，适用于大多数中药材[17-18]。按处方称取中药材，药材粉碎后过0.42 mm筛，称取100 g粉碎后的中药粉末，添加75%乙醇（10倍量），浸泡过夜，20 kHz超声处理40 min，双层纱布过滤，剩下的药渣再加75%乙醇（8倍量），超声处理20 min，双层纱布过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，生药质量浓度浓缩为1 g/mL，4℃冷藏备用。

1.5 提取液纯化方法的筛选

1.5.1 ZTC1+1澄清剂沉淀吸附法（包括A，B共2个组分） 依说明书及参考文献配制A，B组分溶液[19]。A组分：称取A组分粉末2 g，先用少量水调成糊状，然后加适量纯水定容至200 mL，待膨胀24 h后搅拌过滤即得1%黏胶液；B组分：称取B组分粉末2 g，加入少量1%醋酸溶液，搅拌溶解至糊状，然后加1%醋酸定容至200 mL，待膨胀24 h后搅拌过滤即得1%黏胶液。取200 mL生药浓度为1 g/mL的提取液，等分为 4 份，标记为 1，2，3，4 组，水浴加热至80℃，慢速搅拌的同时分别加入A组分黏胶液4，8，12，16 mL，每隔 30 min 左右搅拌一次，2 h 后，于80℃下按同法对应加入制备好的B组分黏胶液2，4，6，8 mL，保温 10 min，30 min 后再搅拌一次，静置6 h后过滤。过滤后沉淀烘干称质量，滤液进行鞣质、蛋白质、澄清度检查，调pH值为6.5，进行抑菌试验。

1.5.2 改良明胶沉淀法 取150 mL生药浓度为1 g/mL的提取液，等分为 4 份，标记为 5，6，7，8 组，水浴加热至50℃后一边快速搅拌，一边缓慢加入5%的明胶水溶液，观察，当上清液不出现沉淀时停止加入。静置30 min，加无水乙醇使乙醇含量为70%，75%，80%，85%，冷藏过夜后过滤，沉淀烘干后称质量记录，减压回收乙醇，滤液进行鞣质、蛋白质、澄清度检查，然后将生药浓度调成1 g/mL，调节pH值为6.5，进行抑菌试验，记录抑菌圈的直径。

1.6 质量检查

1.6.1 澄清度检查 通过眼睛观察检测。取100 mL注射液装于无色玻璃瓶中，背部衬一块黑布，底部衬一块白布用来鉴别有色异物，将药液与人眼放于同一水平线并相距20 cm左右，竖放、横放、倒放检查，每次15 s左右。

1.6.2 pH测定 取3批注射液各20 mL，用pH仪分别测定pH，计算平均值。

1.6.3 鞣质检查 取3批注射液各1 mL，依次滴加1%蛋清生理盐水溶液3 mL（现用现配），静置5 min，观察是否出现浑浊或沉淀。

1.6.4 树脂检查 取3批注射液各5 mL于分液漏斗中，然后加10 mL三氯甲烷轻轻振荡，取上层的三氯甲烷，放在水浴上加热至蒸干，蒸干后剩下的固体物质添加2 mL冰醋酸，待其溶解后，放入具塞试管中，加3 mL水混匀后静置30 min，观察有无树脂状物析出。

1.6.5 蛋白质检查 取3批注射液各1 mL，分别滴加3滴鞣酸试剂，观察是否出现浑浊。

1.7 高效液相色谱法

1.7.1 色谱条件 Waters1525高效液相色谱仪，2489紫外可见光检测器，C18色谱柱（250 nm×4.6 nm，5 μm），流动相为 0.4%磷酸溶液与乙腈，选取322 nm为检测波长，进样量20 μL，流速控制在1 mL/min，洗脱时间30 min，柱温25℃。

1.7.2 对照品与供试品溶液配制 乳香、蒲公英、金银花和黄芩的主要有效成分分别为11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、绿原酸与黄芩苷[20-23]。精密称取11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品6 mg，咖啡酸对照品10 mg及黄芩苷对照品18 mg，分别置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释后定容，备用；称取绿原酸对照品10 mg，加水溶解，稀释后定容，备用。分别吸取配制好的4种储备液各1 mL，置于棕色容量瓶中加水稀释，定容至刻度后摇匀，即得混合对照品溶液；吸取制备的中药注射液1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中加水稀释，定容至刻度后摇匀，过滤即得供试品溶液。

1.7.3 精密度试验 精密吸取配制均匀的混合对照品溶液20 μL，按照1.7.1色谱条件，连续进样6次，记录所测量的色谱峰面积。

1.7.4 稳定性试验 精密吸取中药注射液供试品溶液 20 μL，按照 1.7.1 色谱条件，分别在 0，4，8，12，24，48 h进样20 μL，记录所测量的色谱峰面积。

1.7.5 重复性试验 分别精密吸取同一批中药注射液供试品5份，按照1.7.1色谱条件，连续进样6次，记录所测量的色谱峰面积。

2 结果与分析

2.1 ZTC1+1澄清剂沉淀吸附法纯化结果

从表1可以看出，处理2（A组分加入8 mL，B组分加入4 mL）质量检查合格，澄清度良好，且对3种病原菌抑菌效果最佳。A，B组分不同的加入量在蛋白质与鞣质的处理上面均合格，但并不是随着加入量的增加而对杂质的吸附与澄清效果越好，当澄清剂加入量达到饱和后反而达不到更好的絮凝沉积效果。

2.2 改良明胶沉淀法纯化结果

从表2可以看出，该方法对鞣质和蛋白质的清除效果较好，检测结果符合药典标准，并且澄清度良好，对病原菌的抑菌效果能达到中敏程度以上。

表2 改良明胶沉淀法试验结果

2.3 澄清度检查结果

注射剂整体清亮，竖放、横放、倒放均没有观察到微粒，澄清度检查结果合格。

2.4 pH测定结果

从表3可以看出，3批注射液的pH值之间相差都不超过1，并且pH值在4～9，符合国家药典标准。

表3 pH测定结果

2.5 鞣质检查结果

注射液加新鲜配制的1%蛋清生理盐水溶液静置等待后，药液仍然澄清，没有出现沉淀，检查结果符合规定。

2.6 树脂与蛋白质检查

溶解物加水混匀静置30 min后，没有树脂状物析出；注射液加入鞣酸后，药液澄清，检查结果符合规定。

2.7 高效液相色谱法试验结果

在精密度试验中，11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、绿原酸与黄芩苷的峰面积相对标准偏差分别为0.41%，0.43%，0.39%，0.37%；在稳定性试验中，各色谱峰面积相对标准偏差分别为0.82%，0.89%，0.77%，0.72%；在重复性试验中，各色谱峰面积相对标准偏差分别为0.75%，0.79%，0.72%，0.69%。各色谱峰的相对保留时间较稳定，相对标准偏差均小于1%，上述试验结果表明，在该试验中，仪器精密度良好，中药注射液供试品在2 d内较稳定，且该方法重复性较好。

3 讨论与结论

中药注射剂的质量控制不仅是针对单一的某个环节，而是贯穿整个制备过程。澄清度作为评价其稳定性与质量的主要指标，应当符合国家药典标准。由于中药注射剂成分复杂，在生产过程中温度、酸碱度的变化及附加剂的不合理使用，会影响注射剂色泽、产生沉淀；鞣质、蛋白质等如果没有除尽，不仅会影响澄清度，还会降低药效，严重的会出现过敏反应[24-25]。因此，生产过程中应对制备工艺严格要求，寻求最佳配伍，从而提高中药注射剂的质量。

从提取液纯化方法的筛选中来看，ZTC1+1澄清剂沉淀吸附法，通过比较不同的加入量，可以发现各方面均合格，在蛋白质与鞣质处理中没有太大差别，A组分4%、B组分2%沉淀量略高于其他比例，并且在澄清程度上也好于其他比例。改良明胶沉淀法中，在蛋白质、鞣质处理、澄清程度、抑菌效果上，各方面指标均合格，对金黄色葡萄球菌的抑制方面可达到高度敏感；在处理沉淀方面，加入明胶水溶液处理一段时间后，直接加入乙醇后使明胶变性形成大块儿沉淀，便于过滤[26]，但是各方面结果略差于ZTC1+1澄清剂沉淀吸附法。

高效液相色谱法是对中药材进行质量分析的一种常用方法，其通过对中药材中主要有效成分的分析，能够全面的反映出中药材质量优劣及注射剂中有效成分含量[27]。在200～400 nm波长内对各对照品进行扫描可知，11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、绿原酸与黄芩苷在322 nm波长均有较大吸收；通过比较不同流动相的洗脱效果，选定0.4%磷酸溶液与乙腈为流动相，故最终采用同一色谱条件进行测定。本试验结果表明，该方法对主要有效成分的分离度较高、重复性好，且时间短、操作简单，可作为中药注射剂有效成分的测定方法。

采用超声提取法和ZTC1+1澄清剂沉淀吸附法制备得到的注射液，经澄清度检查、pH测定、高效液相色谱法等一系列检查后，所得试验结果均符合规定，成功制备了防治奶牛乳房炎的中药注射剂。