獭兔源金黄色葡萄球菌16S rDNA鉴定与耐药性分析

张国权，孙乐天，王国艳，王志宇，曹 亮 ，李燕平，任克良

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2.太原动物园，山西太原030009）

葡萄球菌是空气、地面及物体表面等环境中正常存在的细菌，同时，也存在于饲料及饮水中，可在不致病的情况下，寄生在人及畜禽的皮肤、黏膜、肠道、呼吸道及乳腺中[1]。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌中致病性最强的菌株，常引起全身化脓性炎症或致死性脓毒败血症。兔是对金黄色葡萄球菌最为敏感的一种动物[2-5]。2017年7月中旬，山西省某獭兔场獭兔发生以呼吸道症状为主的疾病，剖解病死兔，从其肺脏、皮肤脓包分离得到疑似优势致病菌株，经实验室鉴定，确诊为金黄色葡萄球菌。

本研究对分离出的山西獭兔源金黄色葡萄球菌进行了体外敏感药物试验，以期对由该病原菌引起的呼吸系统、皮肤化脓等病症在临床治疗中的药物选择上起到一定的指导作用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 其来源于山西省某獭兔养殖场病死獭兔的呼吸系统各器官、皮肤脓包。

1.1.2 培养基及试剂 NA固体营养培养基、麦康凯固体琼脂培养基、肉汤液体培养基、鲜血琼脂固体培养基。细菌基因组DNA试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；头孢氨苄、诺氟沙星、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多黏菌素B、卡那霉素、痢特灵、四环素、头孢克罗、头孢曲松、头孢哌酮等14种抗菌药物，均购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.1.3 试验动物 从山西省医科大学实验动物中心购得16只健康（SPF）体质量为30 g的小白鼠，进行攻毒试验。

1.2 试验方法

1.2.1 病原微生物的分离培养

在无菌实验室中对病料进行微生物分离培养，分别划线接种于NA营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和鲜血琼脂培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养24～36 h，观察其生长状态及菌落形态。

1.2.2 涂片镜检 将上述培养物进行纯化培养后，在无菌实验室，用铂金环挑取纯化后的单菌落进行革兰染色、镜检。

1.2.3 动物致病性试验 在无菌实验室，用铂金环挑取纯化后的单菌落培养物，接种于肉汤液体培养液中，置于37℃恒温培养箱，培养24～36 h后，分别接种8只健康试验小鼠，鼻腔滴入菌悬浮液0.2mL/只。选用8只健康小鼠鼻腔滴入0.2 mL无菌肉汤液体培养液作为阴性对照。

1.2.4 分离菌株16S rDNA基因序列测定 按照细菌基因组DNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）提取DNA（1.6 mL培养菌液12 000 r/min离心10 min），将提取到的基因组作为16S rDNA基因PCR扩增模板。根据GenBank数据库查询，用Primer 6.0设计16S rDNA引物，由金唯智基因科技有限公司合成。27F上游引物：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′；533R 下游引物：5′-TTACCGCGG CTGCTGGCAC-3′。

反应体系：超纯水25 uL，DNA模板2.0 μL，5×Pfu Buffer 5.0μL，dNTPs 2.0 μL，Pfu polymerase 0.5 μL，Primer 1和 Primer 2各 1 uL。于 95℃预变性 2 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36 个循环；最后在72℃保温10 min。通过1%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.5 药敏试验 采用国际通用的K-B纸片法，对兽医临床上常见的14种抗菌药物进行体外敏感药物筛选试验。选取的试验药物分别为诺氟沙星、链霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多黏菌素B、卡那霉素、痢特灵、四环素、头孢氨苄、头孢克罗、头孢曲松、头孢哌酮、庆大霉素、阿米卡星。敏感药物的判定，参照美国临床和实验室标准协会[4]的标准，按照其抑菌圈直径的大小进行判定。

2 结果与分析

2.1 临床症状及病原微生物的分离培养

由图1可知，肺部有化脓灶，麦康凯琼脂培养基上生长缓慢；在NA营养琼脂固体培养基上生长出淡灰色、圆形、光滑、隆起、边缘整齐的菌落；在鲜血琼脂培养基上生长出淡灰色、圆形、光滑、隆起、边缘整齐且有溶血环的菌落。

2.2 涂片镜检

在显微镜油镜下观察为单个或呈串状排列的革兰阳性球菌（图2）。

2.3 动物致病性试验

在无菌条件下，剖检试验组死亡小鼠，进行微生物分离培养，结果显示，能够得到与原分离菌株一致的病原菌。

2.4 16S rDNA基因扩增结果

将分离到的菌株，利用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，得到大小约480 bp的目的条带（图3）。

2.5 16S rDNA鉴定结果

将扩增产物送至山西恩兆因生物技术有限公司测序，将测序结果（序列未公布）与NCBI上其他葡萄球菌参考株16SrDNA基因比对分析，结果表明，扩增序列与NCBI公布的KM010139.1参考株同源性达100%，证实该分离株为金黄色葡萄球菌。

2.6 药敏试验结果

本试验分离的金黄色葡萄球菌对庆大霉素、链霉素、多黏菌素B、卡那霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、痢特灵耐药；对头孢氨苄、四环素、头孢克罗中敏;对阿米卡星、阿莫西林、头孢曲松、头孢哌酮敏感（表1）。

表1 34株金黄色葡萄球菌药敏试验结果

3 讨论

本研究确定了山西省该獭兔场因呼吸系统疾病死亡的兔子病因是金黄色葡萄球菌感染，部分有消化道病变，拉水样粪便。金黄色葡萄球菌作为一类重要的可引起人畜共患的细菌性疾病的病原菌，对养殖业及养殖人员安全具有潜在威胁[4-8]。本试验检测了34株獭兔源金黄色葡萄球菌对临床常用药物的敏感性，明确了山西省獭兔源金黄色葡萄球菌分离株的耐药情况，分离的獭兔源金黄色葡萄球菌对链霉素、多黏菌素B、痢特灵、诺氟沙星耐药性较高（97.05%以上），其次为氧氟沙星（94.12%）、卡那霉素（91.18%）和庆大霉素（91.18%）、四环素（8.82%），该结果与王华等[9]报道的兔源金黄色葡萄球菌耐药情况存在一定差异，表明不同地区的同种动物源金黄色葡萄球菌耐药情况存在一定差异，这可能与不同地区獭兔的饲养、管理方式及饲料中抗生素添加的种类和用量等因素有关；与王登峰等[10-13]报道的牛源金黄色葡萄球菌耐药情况相近，表明不同地区的不同种动物源金黄色葡萄球菌的耐药情况存在相近性。细菌的耐药机制不是一个独立的机制，是由不同机制共同协同而成的[14-17]。因其耐药机制的复杂性，一旦产生耐药性，将会给兽医临床治疗带来巨大困难，同时引发公共卫生安全问题[18-20]。

本试验为进一步探究细菌耐药性产生的分子机制研究奠定基础，同时，为本地区的獭兔金黄色葡萄球菌病的治疗提供临床用药指导，但并不具有广泛的通用性和代表性。