分子标记在豆科药食兼用植物研究中的应用

詹海仙，裴香萍，刘计权，尚彩玲，杜晨晖，魏砚明，张朔生

（1.山西中医药大学中药学院，山西 晋中 030619；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西 太原 030031）

豆科植物属于被子植物三大科之一，种植遍及世界各地。豆科植物种类繁多，生产上常见的药食兼用豆科植物有大豆属、菜豆属、扁豆属、落花生属、豇豆属、蚕豆属、槐属、葫芦巴属、黄芪属、决明属、紫云英属、锦鸡儿属、崖豆藤属等。因该科植物含生物碱、皂苷、多糖、黄酮等活性成分，除日常食用外，还具有滋补身体、防治疾病的功效，受到广泛关注[1]。

传统方法选育豆科药食兼用植物品种的缺点是育种周期长，选择效率比较低，费时费力。随着分子生物学和测序技术的快速发展，尤其是分子标记技术的出现，对豆科植物遗传育种产生极大的影响。DNA分子标记可直接反映基因组DNA间的差异，不受植物环境和生长时期的影响，具有多态性高、效率高和稳定性好等优点，可直接实现对豆科植物基因型的准确选择[2]。利用豆科植物已公布的基因组数据信息挖掘各种分子标记，可用于豆科药食兼用植物遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等方面。

1 遗传多样性分析

遗传多样性是物种多样性存在的前提，利用分子标记对豆科药食兼用植物品种间遗传多样性分析，推断品种间亲缘关系，对于提高豆科药食兼用植物的产量和质量具有十分重要的意义。分子标记技术具有多态性高和稳定性好的优点，被广泛应用于豆科药食兼用植物种质资源遗传多样性分析。杨凯敏等[3]对90余份大豆种质进行了遗传多样性分析，发现59个SSR标记中有50对标记具有多态性，共扩增出等位变异154个。ZONG等[4]利用12对AFLP标记对30份中国蚕豆地方品种、136份来自多个国家的蚕豆品种和41份国际干旱地区农业研究中心的蚕豆育种品系进行多样性分析，检测到244条多态性条带，将供试蚕豆分成4大类。宗绪晓等[5]将1 984份豌豆品种进行遗传多样性分析，发现21对SSR标记，将豌豆品种聚合成3大类群。赵波等[6]对5个国家的558份小豆种质资源进行遗传多样性研究，检测出11对多态性SSR标记，产生86个变异位点，并将小豆材料分成5大类。DATTA等[7]采用60对RAPD标记对24个印度绿豆品种进行分析，检测到33对标记，扩增出224条多态性条带，将供试绿豆分成2大类。陈立强等[8]采用SSR标记对42个紫花苜蓿品种进行了遗传多样性研究，15对引物在供试种质中获得163条多态性扩增条带，将供试种质分为5大类。姜丽丽等[9]利用ISSR标记对内蒙古地区30个黄芪样本进行遗传多样性分析，扩增出157个多态性位点，将样本分成2大类。丛晓丽等[10]对8个内蒙古狭叶锦鸡儿进行遗传多样性分析，14对SSR引物均扩增出多态性条带，从而将8个样本划分为4大类。

2 种质资源鉴定

搜集和鉴定国内外植物种质资源，不仅可以拓宽种质资源遗传多样性，加快种质创新和新品种选育，同时还可为进一步遗传多样性分析等研究奠定基础。植物种质资源鉴定涵盖亲缘关系鉴定、品种鉴定、真实性鉴定以及纯度鉴定4个方面[11-12]。豆科药食兼用植物种质鉴定主要采用传统的形态学和生化鉴定方法居多，利用分子标记技术对豆科植物的种质资源鉴定主要涉及大豆属、落花生属和扁蓿豆属的研究[13-14]。菜豆属、豇豆属、蚕豆属、槐属、葫芦巴属、黄芪属等种质资源鉴定仍以籽粒颜色、大小和生育期等农艺性状鉴定为主。曲忠诚[15]利用SSR引物对5个大豆品种进行PCR分析，剔除混杂株，从而进行了大豆原原种的提纯工作。REN等[16]利用146对SSR标记对国内不同地区的196份花生栽培种进行了亲缘关系鉴定，扩增出440个多态性条带，基因多样性的平均值为0.11，86份品种中等位基因频率小于1%。李鸿雁等[17]利用89对SSR引物对50份内蒙古野生扁蓿豆种质资源进行亲缘关系鉴定，其中18对引物扩增出109个等位基因位点，野生扁蓿豆品种间平均遗传距离约为0.2。侯万伟等[18]利用RAPD标记对12个蚕豆品种进行分析，发现1对引物S1可以明确区分蚕豆品种，从而进行蚕豆品种鉴定。

3 遗传图谱构建和基因定位

遗传图谱即基因在染色体上相对应的位置，是进行基因定位和分子标记辅助育种等遗传研究的基础。遗传图谱中分子标记的数量和标记在染色体上的均匀度决定了遗传图谱的质量，因此，需要不断寻找和开发新的分子标记，增加遗传图谱饱和度，为药食兼用植物遗传研究提供丰富的图谱资料。大多数植物的农艺性状和品质性状表现为数量性状遗传方式。数量性状基因定位主要指基因在基因组中的具体位置，是了解基因功能和基因克隆的前提。依靠分子标记进行植物遗传图谱构建和基因定位，被广泛应用于豆科药食兼用植物的研究。国内外学者开展了大量大豆抗病虫害等数量性状基因定位研究工作。CHEN等[19]对大豆种质SX6907的抗锈病基因进行了定位研究，利用11对SSR标记将抗病基因定位到18号染色体上约111 kb区间。ACHARYA等[20]利用2 545个SNP标记和2个SSR标记构建了大豆种质PI 567301B抗赤霉病的遗传图谱，识别的2个QTL位点分别解释了38.5%和8.1%的表型变异。菜豆抗病基因定位方面的研究也比较多见，18个抗菜豆炭疽病基因Co-1～Co-13中，大部分是通过分子标记方法进行的基因定位[21]。朱吉风等[22]利用F2分离群体，构建了菜豆品种龙芸豆5号抗普通细菌性疫病的遗传图谱，该图谱包含12个连锁群206个SSR引物，平均长度137.37 cM。CHEN等[23]通过对菜豆地方品种红芸豆基因组DNA序列分析获得SSR位点，并且据此设计开发出大量SSR标记对菜豆进行基因定位。随着花生第1张以SSR标记为基础的遗传图谱公布，利用分子标记构建花生遗传图谱的文章相继发表[24]。HUANG等[25]利用1 175对SSR标记和42对转座子多态性标记，构建了长度为2 038.75 cM的花生高密度遗传图谱。2014年绿豆全基因组测序和2015年小豆全基因组测序工作的完成，极大促进了绿豆和小豆遗传图谱构建和抗性基因定位工作[26]。王建花等[27]构建了包括11个连锁群的绿豆遗传图谱，95个SSR标记间距约15 cM。通过分子标记分析，豌豆抗白粉病基因er1被定位到第6连锁群，er2基因被定位到第3连锁群[28-29]。王仲怡等[30]对豌豆品系携带的白粉病抗病隐性基因er1-2进行了遗传定位，SSR标记将基因定位到豌豆VI连锁群的er1座位区段。VAZ等[31]利用7个杂交F2群体，通过形态和RAPD标记等构建了包括13个连锁群的蚕豆遗传图谱，并定位了与蚕豆粒质量相关的7个QTL位点，其中，位于第6染色体上的位点解释了30%的表异。

4 分子标记辅助育种

种质资源鉴定、遗传图谱构建和基因定位工作的最终目标是为豆科药食兼用植物育种提供优良种质资源，最终培育优质品种。我国豆科药食兼用植物育种工作总体比较滞后，主要采用引种、农家种提纯复壮、有性杂交等常规的传统育种技术。随着辐射诱变和分子标记辅助选择技术的发展，它们已逐渐应用于豆科药食兼用植物育种中。80余份抗豆象、锈病、叶斑病和白粉病等豆科新种质已通过杂交和分子标记辅助选择获得[32]。中国蚕豆抗病育种和分子标记辅助育种刚刚起步，短期内不太可能育成兼有优质和抗病的蚕豆品种。虽然一些豆科药食兼用植物特定性状的QTL定位已经公布，但其结果的准确性和稳定性还需进一步研究才能确定，而且标记在染色体上的遗传距离较远，需要设计开发更多标记，加密遗传图谱。当前应用于豆科植物的分子标记普遍存在的问题为重复性较差、操作繁琐和成本较高。因此，依托测序数据挖掘覆盖度高、成本低和操作性强的多种分子标记，为开展豆科药食兼用植物分子标记辅助育种提供依据。

5 展望

目前，分子标记技术对豆科药食兼用植物的研究主要集中在抗病虫害等数量性状方面，在其药用活性成分分析、调控有效成分合成的遗传机制和活性成分基因构成等方面却鲜有报道。因此，需要加强豆科药食兼用植物分子标记技术的开发，增加分子标记在药用活性成分方面的研究，明确调控药用活性成分的基因构成，从而合理开发和利用我国丰富的药食兼用植物种质资源。

我国是大多数豆科药食兼用植物的发源地之一，发掘和利用野生近缘种属中的有利基因，同时，开发多种类型分子标记，对原有遗传图谱进行加密，是当前豆科植物育种研究的重点工作。一般常用的标记为RAPD，ISSR，SRAP和SSR等单一的分子标记，尤其是黄芪属物种，常用的仅有SSR和ISSR标记。近年来，随着高通量测序技术的快速发展，利用测序结果可以大规模挖掘基因组特异分子标记，因此，越来越多的物种已经应用测序技术开展了分子标记开发和分子机理方面的研究[33-35]。今后的工作应着重深度挖掘基因组特异分子标记，明确豆科药食兼用植物活性成分的基因组成和调控机制，提高豆科药食兼用植物育种选择的准确性，从而缩短育种时间。

［1］董泽宏.《食疗本草》白话评析 [M].北京：人民军医出版社，2015：12-79.

［2］李力，徐永莉，张朋云，等.DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析[J].时珍国医国药，2009，20（11）：2845-2847.

［3］杨凯敏，李贵全，郭数进，等.大豆自然群体SSR标记遗传多样性及其与农艺性状的关联分析 [J].核农学报，2014，28（9）：1576-1584.

［4］ZONG X，LIU X，GUAN J，et al.Molecular variation among Chinese and global germplasmin springfaba bean areas[J].Plant Breeding，2010，129（5）：508-513.

［5］宗绪晓，关建平，王海飞，等.世界栽培豌豆（Pisum sativum L.）资源群体结构与遗传多样性分析 [J].中国农业科学，2010，43（2）：240-251.

［6］赵波，叶剑，金文林，等.不同类型小豆种质SSR标记遗传多样性及性状关联分析[J].中国农业科学，2011，44（4）：673-682.

［7］DATTA S，GANGWAR S，KUMAR S，et al.Genetic diversity in selected Indian mungbean（（Vigna radiata L.）Wilczek）cultivars using RAPDmarkers[J].AJPS，2012，3（8）：1085-1091.

［8］陈立强，师尚礼.42份紫花苜蓿种质资源遗传多样性的SSR分析[J].草业科学，2015，32（3）：372-381.

［9］姜丽丽，郭九峰，张传领，等.内蒙古道地黄芪种质资源遗传多样性分析[J].中草药，2015，46（15）：2279-2283.

［10］丛晓丽，杨九艳，李晓敏，等.内蒙古高原狭叶锦鸡儿遗传多样性研究[J].中国草地学报，2017，39（1）：85-92.

［11］王述民，李立会，黎裕，等.中国粮食和农业植物遗传资源状况报告（1）[J].植物遗传资源学报，2011，12（1）：1-12.

［12］ROOMI S，SABIHAB，IQBALA，et al.SSR based genetic diversity analysis in a diverse germplasm of groundnut（Arachis hypogaea L.）from Pakistan[J].Aust J Crop Sci，2014，8（1）：55-61.

［13］李莉，万正煌，黄益勤，等.湖北绿豆地方种质资源鉴定和主要农艺性状评价[J].现代农业科学，2009，16（1）：30-36.

［14］白鹏，程须珍，王丽侠，等.小豆种质资源农艺性状综合鉴定与评价[J].植物遗传资源学报，2014，15（6）：1209-1215.

［15］曲忠诚.SSR分子标记在大豆原原种提纯中的应用[J].安徽农业科学，2014，42（26）：8887-8889.

［16］REN X，JIANG H，YAN Z，et al.Genetic diversity and population structure of the major peanut （Arachis hypogaea L.） cultivars grown in China by SSR markers[J].Plos One，2014，9（2）：e88091.

［17］李鸿雁，李志勇，米福贵，等.利用微卫星标记鉴定扁蓿豆种质资源[J].华北农学报，2008，23（3）：67-71.

［18］侯万伟，刘玉皎，李萍，等.12个蚕豆品种RAPD指纹图谱的构建[J].江苏农业科学，2011，39（3）：48-50.

［19］CHEN H，ZHAO S.Genetic analysis and molecular mappingof resistance gene to Phakopsora pachyrhizi in soybean germplasm SX6907[J].Theor Appl Genet，2015，128（4）：733-743.

［20］ACHARYA B，LEE S，ROUF M，et al.Identification and mapping of quantitative trait loci（QTL）conferring resistance to Fusarium graminearum from soybean PI 567301B[J].Theor Appl Genet，2015，128（5）：827-838.

［21］ GONCALVES-VIDIGAL M，LACANALLO G，VIDIGAL FILHO P，et al.A new gene conferring resistance to anthracnose in common bean （Phaseolus vulgaris L.） cultivar'Jalo Vermelho'[J].Plant Breeding，2008，127（6）：592-596.

［22］朱吉风，武晶，王兰芬，等.菜豆普通细菌性疫病抗性基因定位[J].作物学报，2017，43（1）：1-8.

［23］ CHEN M，WU J，WANG L，et al.Development of mapped simple sequence repeat markers from common bean（Phaseolus vulgaris L.）based on genome sequences of a Chinese landrace and diversity[J].Mol Breeding，2014，33（2）：489-496.

［24］VARSHNEY R，BERTIOLI D，MORETZSOHN M，et al.The first SSR-based genetic linkage map for cultivated groundnut（Arachis hypogaea L.）[J].Theor Appl Genet，2009，118（4）：729-739.

［25］HUANGL，RENX.Development and deployment of a high-density linkage map identified quantitative trait loci for plant height in peanut（Arachis hypogaea L.）[J].Sci Rep，2016，6：39478.

［26］KANG Y，KIMS，KIM M.Genome sequence of mungbean and insights into evolution within Vigna species[J].Nat Commun，2014，11（5）：5443.

［27］王建花，张耀文，程须珍.绿豆分子遗传图谱构建及若干农艺性状的 QTL定位分析[J].作物学报，2017，43（7）：1096-1102.

［28］ SRIVASTAVA R，MISHRA S，SINGH A，et al.Development of a coupling-phase SCAR marker linked tothe powdery mildew resistance gene'er1'in pea （Pisum sativum L.） [J].Euphytica，2012，186（3）：855-866.

［29］KATOCH V，SHARMA S，PATHANIA S，et al.Molecular mapping of pea powdery mildew resistance gene er2 to pea linkage group III[J].Mol Breeding，2010，25（2）：229-237.

［30］王仲怡，付海宁，孙素丽，等.豌豆品系X9002抗白粉病基因鉴定[J].作物学报，2015，41（4）：515-523.

［31］VAZ PATTO M，TORRES A，KOBLIZKOVA A.Development of a genetic composite map of Viciafaba using F2populations derived fromtrisomic plants[J].Theor Appl Genet，1999，98（5）：736-743.

［32］程须珍.国家食用豆产业技术体系建设成效显著[J].植物遗传资源学报，2011，12（3）：F0003.

［33］ WU H，CHEN D，LI J，et al.Denovo characterization of leaf transcriptome using 454 sequencing and development of EST-SSR markers in tea （Camellia sinensis）[J].Plant Mol Biol Rep，2013，31：524-538.

［34］CHUNG J，KIM T，SUNDAN S，et al.New cDNA-SSR markers in the narrow-leaved vetch （Vicia sativa subsp.Nigra）using 454 pyrosequencing[J].Mol Breeding，2014，33（3）：749-754.

［35］IEHISA J，SHIMIZU A，SATO K，et al.Genome-wide marker development for the wheat D genome based on single nucleotid polymorphisms identified from transcripts in the wild wheat progenitor Aegilops tauschii[J].Theor Appl Genet，2014，127（2）：261-271.