人乳头瘤病毒分型检测方法学性能评价

王益松，仲崇明

(南京中医药大学连云港附属医院，江苏 连云港222004)

宫颈细胞学检查已普遍应用于宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的筛查，可发现早期病变[1，2]。传统巴氏涂片宫颈细胞学检查存在其固有的局限性[3，4]。高危型HPV核酸检测用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及宫颈癌筛查，可有效地增加宫颈癌病变检出率，提高细胞学检查的敏感性和准确性，并降低筛查频率或避免过度医疗。目前，HPV核酸检测技术很多[5，6]，但无统一标准。确立良好的性能指标并充分理解HPV检测临床意义，对试剂产品方法学分析性能及临床性能评价至关重要。本文参照《人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》（国家食品药品监督管理局，2015年11月26日发布），针对本实验室开展HPV-21分型检测所使用试剂产品作方法学分析性能评价。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 HPV-21分型检测试剂：潮州凯普生物化学有限公司产品；PCR扩增仪：型号为TL-988，为西安天隆科技有限公司产品；导流杂交仪：型号为HHM-2，为广东凯普生物科技股份有限公司产品。HC2二代杂交捕获方法仪器型号为DML2000，为凯杰企业管理（上海）有限公司，试剂为凯杰配套产品。

阳性参考品：批号20170101；A组质粒型别为HPV 6、44、18、33、52、66、CP8304；B 组质粒型别为HPV 11、43、31、45、56、58、68；C 组 质 粒 型 别 为HPV 16、35、39、51、53、59；D 组质 粒 型别为 HPV 42；E 组质粒型别为 HPV 26、54、72、84；HPV 阴性参考细胞系。阳性、阴性参考品均为潮州凯普生物化学有限公司产品。

1.2 评价指标 准确性、交叉反应、特异性、检测限、重复性、干扰。

1.3 方法 准确性：对A、B、C、D组质粒参考品，加样1μl，按程序扩增，按程序杂交，观察阳性符合率；交叉反应：E组质粒加样1μl，按程序扩增，按程序杂交，观察阴性符合率；特异性：HPV阴性参考细胞系按正常程序提取DNA，正常程序扩增、杂交，观察阴性符合率；检测限：A、B、C、D组质粒参考品作2倍、5倍稀释，每管重复5次，各加样1μl，按程序扩增、杂交，观察阳性符合率；重复性：随机选取HPV阳性受检者样本5例，重复2次检测，观察阳性符合率；干扰：设定红细胞、白细胞、异丙醇为干扰因素。在提取后扩增样本中分别加入不同量值异丙醇，正常程序扩增、杂交，观察阳性符合率，以判断异丙醇干扰性；取红细胞、白细胞含量较多，以HC2（二代杂交捕获）方法检测结果为HPV16、HPV18阳性样本各10例，并以HPV-21分型检测试剂（潮州凯普生物化学有限公司产品）检测，观察阳性符合率，以判断红细胞、白细胞干扰性。

2 结果

2.1 准确性 A、B、C、D组质粒共包含高危型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68， 低危型 HPV 6、11、42、43、44、CP8304， 共 21 HPV分型。检测结果均显阳性，“IC”点显色正常（扩增质控点），“Biotin”点显示正常（显色质控点），阳性符合率100%。

2.2 交叉反应 E组质粒型别为 HPV 26、54、72、84，本实验室开展HPV-21分型试剂外HPV型别。实验结果均为阴性，无交叉反应。

2.3 特异性 HPV阴性参考细胞系实验结果为HPV21型别均显阴性，符合产品要求。

2.4 检测限 A、B、C、D组质粒参考品浓度均为350拷贝/μl，当2倍或5倍稀释后，5管重复检测结果均有阴性；350拷贝/μl浓度，各型别5管重复均显示阳性。实验结果显示试剂产品检测限为350拷贝/μl。

2.5 重复性 随机选取HPV阳性受检者样本5例，重复2次检测，2次重复检测结果一致。

2.6 干扰 红细胞、白细胞含量较多样本，以HC2（二代杂交捕获）方法检测结果与HPV-21分型检测试剂（潮州凯普生物化学有限公司产品）检测，阳性符合率 100%；10μl异丙醇加入后，“IC点”（扩增质控点）和HPV阳性样本无阳性反应。

3 讨论

研究[7，8]显示在已知100多种HPV型别中，有30多种型别在宫颈癌中被检测到。HPV分型检测要求：不同基因型别，要有特异的引物和探针；在HPV核酸检测试剂盒设计时，要求考虑到HPV检测限与特异度之间的平衡，避免产生交叉反应；国内试剂盒设计时，不仅要参考国外文献报道的HPV基因型别，还要考虑到国内流行的HPV型别；对试剂盒质量监测需有内标设计及对实验操作有质量控制要求[9]。目前，国内HPV核酸检测（分型检测）已广泛开展，但方法学（试剂）多样[10，11]。 目前 HPV 检测试剂国产与进口均有使用。国外进口主要以PCR荧光探针和酶切信号放大方法为主，约有5家生产企业。国产HPV检测试剂生产厂家近15家，40多种产品[12]。方法学准确性和可靠性不一，尚无统一标准化。在尚没有标准化的情况下，各种方法学性能评价对保证检测结果准确性、可靠性尤显重要。

本文参照《人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》（国家食品药品监督管理局，2015年11月26日发布），针对本实验室开展HPV-21分型检测所使用试剂产品作方法学分析性能评价。结果显示：1准确性：21型别阳性检出率100%，“IC”点显色正常 （扩增质控点），“Biotin”点显示正常（显色质控点）；2 交叉反应 试剂检测21分型之外4个分型 （HPV 26、54、72、84）实验结果均为阴性，无交叉反应；3检测限实验结果显示试剂产品检测限为350拷贝/μl；4重复性 随机选取HPV阳性受检者样本5例，重复2次检测，2次重复检测结果一致；5干扰 红细胞浓度大于0.758×1012/L时，加入白细胞浓度大于18.3×109/L时，异丙醇多于 10μl时，对 HPV 阳性样本有干扰。结果提示本实验室使用HPV-21分型检测试剂产品性能（准确性、交叉反应在、检测限、重复性）符合该产品性能指标要求，符合《人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》分析性能评估指标要求；高浓度红细胞、高浓度白细胞，异丙醇残留量较多可干扰HPV阳性检测。持续高危型HPV感染是诱发子宫颈癌重要原因，目前HPV检测已广泛应用于临床[13-16]，注重HPV检测方法学性能评价，是临床应用的保证，对临床应用有着重要的作用和价值。

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