LncRNA在宣威肺癌中的研究进展

赵瑜综述，段勇审校

(1、昆明医科大学第一附属医院医学检验科，云南 昆明650032；2、云南省实验诊断研究所，云南 昆明650032；3、云南省检验医学重点实验室，云南 昆明650032)

肺癌是目前世界上公认的死亡率和发病率较高的一类癌症，也是癌症相关所致死亡的首要原因。根据2017中国癌症最新数据统计，肺癌成为中国发病率、死亡率双率第一位的癌症。而肺癌中又以非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）占比最高，非小细胞肺癌的类型主要有鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。尽管目前对NSCLC进行了多方面的研究，在诊断和治疗中取得了一定程度的进展，如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）基因检测和靶向治疗，但由于NSCLC缺乏早期临床表现且易发生转移等特点，NSCLC年生存率约为11%[1]。肺癌的潜在分子机制相当复杂，目前已经发现了许多与肺癌相关的基因突变，但是仍然无法阐释所有临床病例的发病机制，因此，进一步发现更精确的诊断及预后分子生物标志物和治疗靶点对于肺癌的研究仍然至关重要[2]。

1 宣威肺癌概述

位于中国云南省东北部的宣威地区的肺癌发病率和死亡率在中国乃至全世界都位居前列[3]。宣威地区的肺癌高发形成了区域特异性，该地具有农村发病率高于城市，女性发病率与男性差别不明显，女性肺癌死亡率居于全国首位[4]，患病和死亡人口年龄提前，肺癌种类多为恶性程度较高的腺癌，患者预后极差等特点。这当中最值得关注的是该地男、女性肺癌死亡率分别是全国平均水平的4倍和8倍[5，6]。一般而言，因为男性吸烟的关系，男性肺癌死亡率通常高于女性，而在宣威地区，当地女性居民基本不吸烟，但肺癌死亡率却与男性相差不大。由于以上种种特殊情况使得该地区成为了肺癌研究的一个特殊区域。

目前大量研究及流行病学分析认为当地室内烟煤燃烧产生的空气污染可能是导致当地肺癌高发的主要原因[7，8]。云南省宣威地区目前是云南省最主要的产煤基地之一，当地有数量众多的小煤窑。宣威煤炭以龙潭镇和来宾镇产煤为主，而研究发现宣威地区煤炭中烃、硫、微量元素和矿物组成方面与云南省富源县等地所产的煤存在显著差异，其中挥发性的有机物质是富源煤炭的5-10倍，石英的含量超过富源煤炭2倍以上[9]。最新的环境研究表明，二氧化硅和多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的交互作用是导致宣威地区肺癌高发的直接原因[10]。在80年代以前，宣威当地农村多采用“火塘”烧火做饭，燃烧煤炭所产生的烟尘无法及时完整地排出室内，造成较为严重的室内空气污染。宣威某些地区农村女性肺癌发病率和死亡率高达400/10万，她们虽未从事煤矿开采、炼焦，但每天在以燃煤为主要能源的室内活动超过10h以上[11]，这提示长期暴露于多环芳烃类等室内污染的居民患肺癌的风险增加[12，13]。同时，研究还发现虽然居民生活同样使用烟煤，但由于使用煤源的不同，不同地区肺癌死亡率相差数倍至数十倍之多；即使是同一地区不同家族、同家族中有血缘关系的一级亲属与配偶家系间肺癌的发病风险差别也很大，肺癌流行具有明显的家族聚集性，在肺癌的发生过程中基因变异可能起到了重要作用。在八十年代末期，宣威地区进行了改炉换灶等治理措施，使得室内多环芳烃化合物的含量明显降低，一段时间内宣威地区的肺癌发病率有一定的下降，但仍未彻底改变宣威肺癌的高发病率和死亡率的现状[14，15]。

由于宣威肺癌的独特性，近年来关于宣威肺癌研究更多地集中在宣威肺癌的分子机制方面。但是肺癌的发生发展是一个多基因参与、多阶段发展的极其复杂的病理过程，并伴有大量基因的异常表达，不同的基因相互作用形成复杂的分子网络，共同调控肿瘤细胞的生物学过程，导致肿瘤的浸润、侵袭、转移等[16]，因此任何单一水平的研究都难以揭示肺癌发生发展的分子机制，只有综合、系统的研究才有可能阐明。宣威肺癌独有的地域性特点，更是环境与基因互相作用结果的典型。由于宣威肺癌特殊的高发病率及高死亡率严重威胁宣威地区乃至其他相似地区人口的生命健康，所以研究宣威肺癌发生发展的机制以及诊断和治疗至关重要。随着近年来分子生物学研究的飞速发展，目前对宣威肺癌分子机制的研究主要集中在基因多态性、 微小 RNA（microRNA，miRNA）、DNA的甲基化与损伤修复、基因拷贝数变异（CNVs）、长链非编码 RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）以及信号通路等方面。

2 肿瘤相关lncRNA的研究进展

长链非编码 RNA （Long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA[17]，在哺乳动物基因组普遍被转录，它是由RNA聚合酶II转录而成的，因为缺乏开放读码框，所以lncRNA不具有编码蛋白质的功能，lncRNA在结构特点和序列组成方面和编码蛋白质RNA的3’UTRs相似，其表达具有时空特异性。lncRNA的表达受到发育调控，具有组织和细胞特异性。研究表明lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、干扰、核内运输等多种重要的调控过程[18]。研究发现，lncRNA的表达或功能异常与人类疾病的发生密切相关，这当中就包含了癌症、退行性神经疾病在内的多种严重危害人类健康的重大疾病，具体表现为lncRNA在序列和空间结构上的异常、表达水平的异常、与结合蛋白相互作用的异常等[19]。目前发现近43%的疾病相关单核苷酸多态性出现在编码蛋白质的区域之外，这揭示了lncRNA与疾病的密切相关性[20]。目前研究较明确与肿瘤相关的lncRNA有：MALAT-1、H19、HOTAIR、MEG3 与 ANRIL。

HOX转录反义RNA （Hox transcript antisense RNA，HOTAIR）全长2158个碱基，首次被发现反式转录作用调控基因的表达，研究表明HOTAIR的表达水平与多种肿瘤（如乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、喉癌等）的发生发展以及转移预后密切相关，高表达的HOTAIR能抑制抑癌基因的表达，促进肿瘤复发转移，而下调的HOTAIR表达则降低肿瘤细胞的转移侵袭能力，近期研究发现HOTAIR可能通过竞争性结合miR23b并间接调节宫颈癌细胞中的MAPK1的表达从而促进宫颈癌细胞的增殖和转移[21]。

肺癌转移相关转录本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1) 属lncRNA家族重要成员，2003年在非小细胞肺癌研究中被发现，近年来已逐步引起学者关注，研究发现MALAT-1在肺癌中明显上调并且能够促进非小细胞肺癌中的细胞增殖和迁移[22]。

人母系表达基因（maternally expressed gene3，MEG3）位于人染色体14q32.3[23]，在人的脑、肾上腺、胎盘、睾丸、肝脏等组织中均有MEG3的表达，而在多种人类癌症组织及细胞株中检测出MEG3呈低表达，研究还报道，MEG3基因的缺失能导致脑膜瘤[24]、胃癌[25]、宫颈癌[26-28]的发生，因此 MEG3被认为是肿瘤抑制因子。研究发现MEG3可能影响 TP53，MDM2，GDF15，RB1 等关键细胞周期调节因子的活性，参与癌症的进展和化疗敏感性[29]。

虽然肺癌诊断技术在不断提高，但有学者指出仍有40%的NSCLC患者被诊断为局部进展期或晚期的肺癌，这些患者通常不能进行手术切除，预后较差[30]，因此对肺癌的快速、准确的诊断显得尤为重要。研究发现lncRNA在肺癌中的异常表达与肺癌的发生发展以及肺癌相关的mRNA、miRNA等有明确关系。且lncRNA具有较好稳定性、高特异性和易获得等优点，这些优点表明lncRNA有可能成为肺癌的潜在生物诊断标记物。研究这些lncRNA在NSCLC组织、血液中的表达，有助于研发特异性诊断标志物，提高NSCLC患者的检出率。近年来研究对与肺癌相关的lncRNA日趋增加，目前主要集中于 HOTAIR[31，32]、HOXD-AS1[33]、XIST[34]、PVT-5[35]、PANDAR[36]等 lncRNAs 在 肺 癌 的 发 生发展中的功能与机制的研究。而目前针对宣威肺癌相关的lncRNA研究较少，但由于宣威肺癌的独特性以及lncRNA与肺癌发生的密切相关性，与宣威肺癌相关的lncRNA逐步成为研究热点。

3 宣威肺癌相关lncRNA的研究

研究宣威肺癌相关的lncRNAs首先从发现宣威肺癌组织中与其相配对的癌旁组织中具有差异表达的lncRNAs入手。由于宣威肺癌患者组织的获取有一定难度，因此对宣威肺癌的研究需要更深入广泛的发掘。Li，Q[37]等通过LncRNAs芯片对5对云南宣威肺癌及癌旁组织中具有表达差异性的lncRNAs进行了筛选和分析，发现了6个在宣威肺癌组织及癌旁组织中差异表达且可能具有研究意义的 lncRNAs，SGOL1-AS1、SNHG4、PVT1、FENDRR、H19以及PWRN1。其中通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-PCR）技术验证了这6个lncRNAs在33对宣威肺癌及癌旁组织中的表达水平。实验发现在宣威地区肺癌组织SGOL1-AS1、SNHG4、PVT1 表 达 呈 上 调 ， 而FENDRR、H19以及PWRN1表达呈下调，RT-PCR结果与芯片结果相符。研究证明目前应用lncRNA芯片来对宣威肺癌进行初步分析是相对可靠的。这6个lncRNAs中 H19、FENDRR、PVT1已经在其他癌症中被研究发现，但更多的像SGOL1-AS1、SNHG4、PWRN1等lncRNAs可能属于宣威地区肺癌所特有的致病基因，目前并未有进一步研究，而宣威肺癌芯片检测结果中包含了大量此类lncR鄄NAs，这提示lncRNA在宣威肺癌的研究具有较高的潜在研究价值。

对宣威肺癌相关lncRNA的进一步研究则集中在了FENDRR上。早期研究发现lncRNA FENDRR在胃癌中呈低表达并且与预后不良相关，lncRNA FENDRR在胃癌的进展和转移中发挥了重要的作用[38]。最近有研究证明lncRNA FENDRR在前列腺癌中同样也呈低表达水平，并且可以通过结合miR-18a-5p来调节靶基因的表达，从而影响癌细胞的增殖和迁移等功能[39]。徐然[40]等通过研究证明，lncRNA FENDRR在非小细胞肺癌细胞株A549细胞中的过表达能够显著抑制A549细胞的增殖，并且通过流式细胞技术能够检测到FENDRR的过表达还能够诱导细胞的凋亡。而陈冉[41]等通过RT-PCR技术检测发现FENDRR在宣威肺癌细胞株XWLC-05细胞中的表达明显低于A549细胞株中表达水平，这一实验证明了lncRNA FENDRR在宣威肺癌可能存在更低的表达，甚至可能与宣威肺癌的高度恶性和预后不良具有相关性。进而通过在构建慢病毒载体在XWLC-05细胞中过表达FENDRR，构建了lncR鄄NA FENDRR的稳定转染株，运用MTS法、Tran鄄swell结合Matrigel胶法进行体外细胞功能研究，研究发现lncRNA FENDRR在宣威肺癌中具有明显抑癌活性，并且可以通过调节相关的基因表达从而抑制细胞增殖、迁移和转移等细胞功能。研究还发现lncRNA FENDRR参与了多条信号通路的调节，经过生物信息学分析与检索的到了更多lncRNA FENDRR相关的分子机制，而这些富集基因的信号通路和分子机制很有可能围绕lncRNA FENDRR为宣威肺癌的诊疗提供更新更深入的研究。

经过对宣威肺癌与非宣威肺癌患者的血清进行对比检测，发现在宣威肺癌患者的血清中lncR鄄NA FENDRR和lncRNA H19的表达水平呈下调趋势，且H19的表达水平与患者的淋巴结转移情况相关。并且当联合检测FENDRR与H19时，AUC（Area Under Curve）值明显高于癌胚抗原（car鄄cinoembryonic antigen，CEA）的 AUC 值，这项研究更进一步证明FENDRR与H19的诊断价值高于传统标志物，并且有可能作为宣威肺癌的潜在诊断标志物[42]。

空气污染一直是我国严重的公共卫生问题，据报道近年来与空气污染密切相关的肺腺癌比例迅速增至60%以上，超过已被证实的主要和烟草中有毒物质相关的肺鳞癌。研究证实PM2.5可以承载十几种致癌物质，其中苯并芘（Benzopyrene，BaP）等多环芳烃与肺癌的患病率呈明显相关性。而早期关于宣威肺癌的研究证明[43-45]，宣威地区燃烧烟煤所导致的室内和室外空气污染可能是宣威肺癌发病的特殊性的原因之一。Ming-Ming Wei等[46]通过筛选来自宣威肺癌患者肿瘤组织中异常表达的lncRNAs，发现宣威地区患者异常表达的lncRNAs中lncRNA CAR10的表达上调远高于对照（非烟煤燃烧地区的肺癌患者）组，进一步研究发现lncRNA CAR10的表达与宣威地区的空气污染是相关的，CAR10通过与YB-1直接结合并且抑制蛋白酶体对YB-1的降解来上调YB-1的表达，从而引起EGFR/pEGFR，pAKT和pERK的上调来促使肺癌细胞体内外的增殖。研究结果表明lncRNA在环境污染相关肺癌的发生具有很重要的作用。

4 结语

随着现代临床治疗手段的不断进步和发展，个体化医疗以及靶向治疗成为了针对癌症更为有效的治疗方法，而今分子生物学技术的飞速发展更是为癌症的发生发展提供了更多研究方向。宣威肺癌以独特的流行病学特征以及严重的空气污染，为肺癌病因学和分子机制的研究提供了契机。如今越来越多的lncRNA不断被发现，lncRNA的在疾病中所发挥的功能也越来越多地被发掘出来，并且lncRNA具有特异性、稳定性以及易获得性等优点，使其可能成为诊断肺癌的分子生物学标记物，针对lncRNA的靶向诊治措施也为宣威肺癌的研究提供了新的思路。但是，因为有关lncR鄄NA的靶向治疗研究尚在起始阶段，lncRNA的功能与其所涉及的机制都尚未完全清楚，所以需要对lncRNA进行更深入的研究和探索以发现更有效的靶点。