一贯煎对子痫前期大鼠胎盘NF-κB mRNA与MMP-9 mRNA表达影响*

黎 燕 ，曹保利 ，刘 筠

子痫前期是妊娠期有着特殊临床特征的多系统疾病,在世界范围内影响着2%～8%的妊娠,是孕产妇发病和死亡的主要原因[1－2]，尤其是在低收入和中等收入的国家[3－4]。其发病病机和病因尚未完全明确,胎盘浅着床理论被广泛接受，基质金属蛋白酶－9（MMP－9）作为基质金属蛋白酶的重要成员，在滋养细胞的浸润过程中发挥着核心作用，核转录因子（NF－κB）是多种重要前炎性因子的转录激活因子，通过对表达过程中最重要的环节即转录水平的调节来发挥其重要功能。一贯煎为中医经典滋阴名方,临床上对妊娠期高血压疾病有治疗作用，本研究通过一氧化氮合成酶抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯（L－NAME）建立子痫前期大鼠模型，用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法检测各组大鼠胎盘NF－κB mRNA和MMP－9 mRNA的表达，探究一贯煎对子痫前期大鼠胎盘NF－κB mRNA和MMP－9 mRNA表达的影响。

1 实验方法

1.1 分组及建立模型 将符合要求的孕鼠纳入实验，妊娠第10天测量孕鼠血压并测24 h尿蛋白。妊娠第12天将孕鼠随机分为两组：正常妊娠组10只，子痫前期模型组26只，子痫前期模型组于妊娠13 d至妊娠第19天皮下注射L－NAME 50 mg/（kg·d）建立大鼠子痫前期模型，正常妊娠组则注射等量生理盐水。妊娠第15天再次测量各组孕鼠血压及24 h尿蛋白，将子痫前期模型组符合诊断标准的23只孕鼠随机抽取20只纳入实验，进行第2次分组，随机分为模型对照组10只，一贯煎治疗组10只，从妊娠16 d开始，C组加用一贯煎颗粒，B组加注同等剂量的生理盐水，灌胃给药，直至妊娠19 d。

1.2 标本采集及指标检测 妊娠第10天、妊娠第15天、妊娠第19天测量各组孕鼠血压并收集24 h尿，送本院实验室测量24 h尿蛋白。

1.3 标本采集与处理 各组大鼠妊娠第20天收集24 h尿后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取出胎鼠和胎盘，选取胎盘组织生理盐水漂洗后保存于－70℃备用。以RT－PCR法检测各组孕鼠胎盘组织NF－κB mRNA及MMP－9 mRNA的表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，实验数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胎盘中NF－κBmRNA表达比较 与正常妊娠组比较，模型对照组、一贯煎治疗组NF-κB mRNA表达均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），一贯煎治疗组较模型对照组相比，NF-κB mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠胎盘中NF-κB mRNA表达的比较（x±s）Fig.1 Comparison of the expression of NF-κB mRNA in placenta of rats in each group（x±s）

2.2 各组大鼠胎盘中MMP-9 mRNA表达比较 与正常妊娠组比较，模型对照组、一贯煎治疗组MMP-9 mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），一贯煎治疗组较模型对照组相比，MMP-9 mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组大鼠胎盘中MMP-9 mRNA表达的比较（x±s）Fig.2 Comparison of the expression of MMP-9 mRNA in placenta of rats in each group（x±s）

3 讨论

目前妊娠期高血压疾病的发病病机和病因尚未完全明确,子宫浅着床被众多学者所认可，妊娠期高血压疾病患者的滋养细胞侵袭能力减弱,造成妊娠期胎盘床的血管重铸发生障碍,胎盘植入过浅，导致胎盘缺血缺氧，最终出现临床症状。免疫失调或免疫不匹配可能与妊娠期高血压疾病的发生有着重要联系。滋养细胞的整个浸润过程包括黏附、基质的溶解、和细胞的迁移，在此过程中的重要环节为溶解基质，它为滋养细胞的侵蚀扫除了物理屏障，但是滋养细胞本身不能吞噬和溶解基质，只能分泌作用于细胞外间质的酶：基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶/半胱氨酸蛋白酶蛋白酶等，其中基质金属蛋白酶（MMPs）是一组降解细胞外基质、结缔组织蛋白的蛋白酶家族[5-6]，是降解蜕膜基质的重要酶类，几乎能降解全部的基质成分，在胚胎的植入、胎盘的形成、和子宫螺旋动脉重铸等过程中发挥着重要的作用。MMP-9属胶原酶类[8]，目前被证明为最有效的蛋白水解酶，其分泌量直接关系到胎盘滋养细胞的侵袭力和血管的重铸，纯化的抗MMP-9抗体可以阻断滋养层细胞对基质的浸润，表明MMP-9在滋养层细胞植入中起重要作用[7]，MMP-9的表达不足,导致滋养细胞对子宫螺旋动脉的侵袭不足，胎盘浅植入，造成胎盘血血流灌注不足，胎盘缺血，进而损伤母体血管系统，最终引发临床症状。

NF－κB蛋白家族，是最近几年来最有研究潜力的调节免疫反应的转录因子。正常情况下，它以非活性形式存在于胞浆中，由P50/P65和IkB组成[8]。在胞外刺激下，NF-κB三聚体复合物中的IkB发生磷酸化而解离，而NF-κB二聚体由胞浆移位至胞核，并与NF-κB反应基因启动子区域的kB位点相结合，从而启动这些基因的转录，从而实现对细胞因子、黏附分子、趋化因子等的调控，相关研究提示，NF-κB存在于人类滋养细胞中[10]。有学者发现妊高征孕妇血浆中升高的过氧化物可以使培养的人脐静脉内皮细胞中NF-κB活化提高，并显著上调细胞表面细胞间粘附分子-1的表达，提示NF-κB有可能在妊娠期高血压疾病中的发病机制中起重要作用[11]。妊娠期由于胎盘低氧，激活NF-κB，一方面使滋养细胞增殖与凋亡的失调，从而使滋养细胞的浸润能力减弱；另一方面在滋养细胞的浸润活性形成的过程中，血管内皮细胞激活与损伤，血管内皮细胞功能发生异常，释放的毒性因子使血管变得狭窄，不利于胎盘血管重铸。同时滋养细胞凋亡时产生的一些细胞因子，使人核因子κB抑制蛋白（IκB）发生磷酸化，导致机体内的细胞因子的表达，使血管壁平滑肌细胞增生，促使血管壁增厚，血管痉挛，降低胎盘的血流灌注量，使胎盘缺血、缺氧，最终导致全身血压增高。

NF-κB与MMP-9共同参与了滋养细胞侵蚀和胎盘血管重铸，在妊娠中的意义重大，它们表达的异常可导致子痫前期的发生。研究结果子痫前期大鼠的胎盘NF-κB mRNA表达较正常妊娠组明显升高，MMP-9 mRNA则明显降低，经一贯煎治疗后，NF-κ BmRNA较子痫前期组明显降低，MMP-9 mRNA明显升高。结果表明一贯煎以下调NF-κB，上调MMP-9的表达来治疗子痫前期，为临床治疗子痫前期提供了新的思路。

在中医学中，子痫前期属“子肿”“子晕”“子痫”范畴[12]，阴虚阳亢、上扰清窍是其主要病机，临床上该病患者以肝肾阴虚者多见，多表现为肝阴不足的诸多症状，治疗多以滋阴为主，方选一贯煎加减。一贯煎为中医经典名方，由名医魏之琇所创，此方由北沙参、麦门冬、生地、当归、枸杞、川楝子组成，具有滋阴疏肝的功效，可用于治疗肝阴亏虚所致的多种疾病。一贯煎组方严谨、配伍精当，方中重用生地滋阴壮水，配伍枸杞子补肝血、养肝体以和肝用；再入甘寒质润之麦冬、沙参补养肝胃之阴,使肺胃津旺，金气清肃下行,自能制木;更入少量川楝子,性寒不燥,既能疏泄肝气,又能顺肝木条达之性,且制诸药滋腻碍胃之弊[13]。有研究报道一贯煎加减对高血压及妊娠期高血压疾病疗效显著[14-15]。

本研究结果显示：子痫前期大鼠的胎盘NF－κB mRNA表达较正常妊娠组明显升高，MMP－9 mRNA则明显降低，经一贯煎治疗后，NF－κB mRNA较子痫前期组明显降低，MMP－9 mRNA明显升高。这表明：一贯煎以下调NF－κB，上调MMP－9的表达来治疗子痫前期，为临床治疗子痫前期提供了新的思路。

[1] Steegers EA,von DP,Duvekot JJ,et al.Pre-eclampsia[J].Lancet,2010,376:631-644.

[2] Von DP,Magee LA.Pre-eclampsia:an update[J].Curr Hypertens Rep,2014,16:454.

[3] Souza JP,Gülmezoglu AM,Vogel J,et al.Moving beyond essential interventions for reduction of maternal mortality(the WHO Multicountry Survey on Maternal and Newborn Health):a cross-sectional study[J].Lancet,2013,381:1747-1755.

[4] Zanette E,Parpinelli MA,Surita FG,et al.Maternal near miss and death among women with severe hypertensive disorders:a Brazilian multicenter surveillance study[J].Reprod Heal,2014,11:4.

[5] Visse R,Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metal-loproteinases:structure,function,and biochemistry[J].Circ Res,2003,92:827-839.

[6] Raffetto JD,Khalil RA.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease[J].Biochem Pharmacol,2008,75:346-359.

[7] Verrecchia F,Mauviel A.Transforming growth factor beta signaling through the smad pathway role in extracellular matrix gene expression and regulation[J].J invest Dermatol,2002,118(2):211-215.

[8] Sasaki H，Sato T,Yamauehi N,et al.induction of heat shork Protein 47 synthesis by IGF-bata and IL-I bata via enhancement of heat shork element binding activing of heat shork transcription factor[J].J Immunol,2002，168(10):5178-5183.

[9] Lee JI.Nuclear factor kappaB:Important transcription factor and therapeutic target[J].J clin pharmacol,1998,38:981-993.

[10]Kniss DA,Rovin B,Fertel RH,et al.Blockade NF-kappaB activation prohibits TNF-alpha-induced cyclooxygenase-2 gene expression in ED27 trophoblast like cells[J].Placenta.2001,22(1):80-89.

[11]Takacs P,Kauma SW,Sholley MM,et al.Increased circulating lipid peroxidesin severe preeclampsia activateNF-kappaB and upregulate ICAM-1 in vascular endothelial cells[J].FASEB J,2001,15(2):279-281.

[12]张玉珍．中医妇科学[M]．第7版.北京：中国中医药出版社，2007:230-239．

[13]魏道祥．一贯煎之探析[J]．中国中医基础医学杂志，2011，17(5):563，565．

[14]张 磊,张继红,李媛媛.一贯煎治疗单纯收缩期高血压的临床观察[J].湖北中医杂志,2011,33(12):12-13.

[15]孙保华.一贯煎加味治疗妊娠高血压综合征的疗效观察[J].职业与健康,2003,19(7):117.