醋酸尼泼松对皮状丝孢酵母产微生物油脂的影响

汪 洲 许鹏飞 肖玲玲 王 栋 龚大春

(1. 三峡大学 生物催化重点实验室，湖北 宜昌 443002；2. 湖北三峡职业技术学院，湖北 宜昌 443002；3. 车用生物燃料技术国家重点实验室，河南 南阳 473000)

面对化石燃料的日益枯竭，环境的不断恶化，寻求新的可再生的清洁能源成为一种必然趋势．生物柴油是一种可以直接代替化石燃料，用于柴油发动机燃烧的清洁、可再生能源[1]．在我国近十年来得到较大范围的推广．但由于其原料主要来源于地沟油、植物油下脚料等，致使生物柴油的生产原料来源不稳定、成份复杂、价格波动大，极大限制了生物柴油的正常生产供应．因此开发稳定、清洁、可再生的生物柴油原料成了近年来的研究热点．

微生物油脂是一种利用微生物，比如酵母菌、藻类、霉菌等在一定生长条件下将碳氢化合物、碳水化合物等在体内生产积累产生的油脂[2-3]，其油脂主要成分为甘油三酯(TAG)，在组成上与植物油如棕榈油、菜籽油相似，以C16和C18油脂为主，可规模化生产，环保．有研究表明酵母油脂可以用于生物柴油的制备[4]，具有较好的产业化前景．但一般酵母油脂含量在25%左右，其菌种选育和发酵工艺优化至关重要[5-6]．糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，具有调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢的作用，因此本文拟研究糖皮质激素药物醋酸泼尼松对皮状丝孢酵母的生长影响，以及对生物油脂积累的贡献，旨在提高皮状丝孢酵母合成生物油脂的能力．国内尚无相关文献报道．

1 材料与方法

1.1 菌种

皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)由三峡大学艾伦·麦克德尔米德再生能源研究所提供．

1.2 培养基

斜面培养基(%)：葡萄糖1，蛋白胨1，酵母浸粉0.5，琼脂2．种子液培养基(%)：蔗糖2.5，酵母浸膏0.6，麦芽浸粉0.5，硫酸镁0.05，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾0.1．发酵培养基(%)：葡萄糖6，酵母浸膏0.6，麦芽浸粉0.5，硫酸镁0.05，硫酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾0.1．

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

用接种环从原始菌种中蘸取少量菌液接种到斜面上，30℃培养3 d．

1.3.2 皮状丝孢酵母生长曲线测定

从活化的斜面上挑取一个菌落接种到100 mL种子液培养基中，在28℃，200 rpm培养，每隔2 h取出少量菌液，以没有接种的种子液为空白，用波长为600 nm的分光光度计测定生物量，记录吸光值．以培养时间(h)为横坐标，以吸光值(OD600)为纵坐标绘制酵母生长曲线．

1.3.3 种子液制备

从活化的斜面上挑取一个菌落接种到100 mL种子液培养基中，在28℃，200 rpm培养至对数期和稳定期交叉所对应时间点．

1.3.4 发酵培养基制备

按10%的接种量从培养好的种子液中吸取10 mL种子液接种到100 mL含不同浓度醋酸泼尼松的发酵培养基：在基本培养基中添加不同质量浓度的醋酸泼尼松mg/L(0，50，100，150，200，250，300)，以不添加醋酸泼尼松的发酵培养基作为空白对照，培养48 h．

1.3.5 生物量的测定

将培养90 h的发酵培养基取出，将发酵液倒入离心管中配平，8 500 rpm离心10 min，取出离心管，去除上清液，用去离子水洗涤菌体3次，将菌体倒入已称重(M1)的滤纸上，放入80℃烘箱中烘干至恒重．取出滤纸用分析天平精确称重(M2)，则干菌体量为M=M2-M1．

1.3.6 菌体油脂提取

将发酵培养48 h的发酵液8 500 rpm离心10 min集菌，放入烘箱烘干，每克干菌体加入5 mL 8 mol/L的盐酸，混合均匀后室温静置1 h，然后沸水浴处理10 min，迅速冷却，恢复到常温后加入2倍体积的氯仿-甲醇(V∶V=2∶1)溶液，混合均匀后室温静置30 min，4 500 rpm离心10 min．萃取得氯仿层，上层溶液再加10mL氯仿，振荡均匀，离心，进行二次萃取得氯仿层，合并氯仿．旋转蒸发除去氯仿得油脂，称重[7-8]．

酵母细胞油脂含量=油脂质量/干菌体量×100%

油脂产量(g/L)=酵母细胞量(干重)×油脂含量/总装样(L)×100%

1.3.7 油脂成分分析

油脂甲酯化：取1mL油脂放入15 mL离心管中，加入石油醚-乙醚(3∶1)3 mL，浸润提取15 min后，再加入0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液1 mL，震荡摇匀后放于50℃水浴15 min左右即可，取出后沿管壁加入5% NaCl溶液使有机层上升[9-10]，静置分层后，用注射器取其上层清液，经过滤后加入到1.5 mL的气相色谱样品瓶内，进行气相分析．

气相色谱检测：色谱柱为毛细管柱(DB-FFAP)，进样口温度280℃，分流比为30∶1，流量为1.0 mL/min，柱温60℃保持1min，25℃/min升温到200℃不保持，3℃/min升温到230℃保持20 min．检测器温度为280℃，H2流量40 mL/min、空气流量450 mL/min、尾吹流量30 mL/min．对亚油酸和油酸采用外标法进行定量测定．

2 结果与讨论

2.1 皮状丝孢酵母接种时间选取

从图1可以看出皮状丝孢酵母的生长分为以下几个时期：0～10 h是为菌体迟缓期；10～20 h为菌体对数生长期；20～50为菌体生长稳定期．因此选取培养18～20 h的种子液接种到发酵培养基中，此时菌龄的酵母活力最高．

图1 皮状丝孢酵母生长曲线

2.2 醋酸泼尼松对皮状丝孢酵母生长的影响

从图2可以看出，醋酸泼尼松添加对皮状丝孢酵母的生长有显著的影响．当醋酸泼尼松添加到100 mg/L的时候，皮状丝孢酵母菌体量从最初的9.7 g/L增加到最大值16.3 g/L，增长了68%．可见醋酸泼尼松对皮状丝孢酵母菌体的生长有着极大的促进作用，能使菌体大量生长繁殖，对单细胞中生物油脂含量影响有待进一步确证．

图2 醋酸泼尼松的不同用量对皮状丝孢酵母生长的影响

2.3 醋酸泼尼松对皮状丝孢酵母油脂积累的影响

从图3、图4可以看出，添加醋酸泼尼松溶液后，油脂含量和油脂产率均有较大变化．在醋酸泼尼松低质量浓度区域(100 mg/L以下)时，由于菌体量增加较快，生物油脂在细胞中含量只是缓慢增加，大部分营养用于细胞合成，此时醋酸泼尼松对酵母细胞脂肪积累促进作用不大；但当醋酸泼尼松质量浓度达到200 mg/L时，醋酸泼尼松对酵母细胞脂肪积累促进作用明显增强，含量可以提高40%；此时菌体浓度也较高，油脂产量从2.5 g/L增加到4.8 g/L，油脂产量提高了92%．

图3 醋酸泼尼松的不同用量对皮状丝孢酵母生物油脂积累的影响

图4 醋酸泼尼松的不同用量对皮状丝孢酵母生物油脂产量的影响

根据油脂含量和油脂产量综合分析可知，低浓度区域的醋酸泼尼松有助于菌体的生长，但对单个酵母中的油脂积累影响不明显，较高浓度的醋酸泼尼松更加有利于油脂的积累．当醋酸泼尼松质量浓度增加到250 mg/L时，油脂增加量略有下降，可能与醋酸泼尼松毒性增加有关．研究表明，醋酸泼尼松添加量对皮状丝孢酵母菌体量增加和对油脂含量影响并不同步，为了保证前期菌体生长和后期油脂积累，可以从工艺上选择分步添加方法，实现皮状丝孢酵母生物油脂产量的最大化．

2.4 分批添加醋酸泼尼松用量对皮状丝孢酵母生物油脂产量的影响

采用在皮状丝孢酵母快速增值期间，发酵30 h前添加量控制醋酸泼尼松用量在100 mg/L，然后在发酵第30 h的时候，补加醋酸泼尼松用量到200 mg/L，进行试验．通过测定油脂结果表明：分批添加添加醋酸泼尼松用量皮状丝孢酵母，前期保证酵母生长，后期保证皮状丝孢酵母油脂积累达到最大是可行的．通过50 h培养，可以达到皮状丝孢酵母油脂产量5.7 g/L，比一次添加醋酸泼尼松所产微生物油脂再提高19%．

图5 分批添加醋酸泼尼松对皮状丝孢酵母生物油脂产量的影响

2.5 皮状丝孢酵母油脂脂肪酸组成

从图6、7可以看出，皮状丝孢酵母中生物油脂成分添加醋酸泼尼松前后油脂主要成分相同，说明醋酸泼尼松未改变油脂的合成途径，但与和菜籽油等植物油成分相似，均含有十六烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸，但没有亚麻油、花生酸甘油酯；与此同时，虽然添加醋酸泼尼松后对皮状丝孢酵母中生物油脂种类没有影响，但对油脂脂肪酸中油酸、亚油酸含量有较大影响，分别增加21.6%、32.3%．皮状丝孢酵母所产油脂可以用于合成生物柴油，为绿色可再生的能源-生物柴油的生产提供优质原料，不与人争粮．

1.十六烷酸甲酯；2.硬脂酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亚油酸甲酯图6 皮状假丝酵母油脂主要成分谱图

1.十六烷酸甲酯；2.硬脂酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亚油酸甲酯；5.亚麻酸甲酯；6.花生酸甲酯；7.花生-烯酸甲酯图7 菜籽油脂肪酸甲酯气相谱图

3 结 论

研究表明，醋酸泼尼松对皮状丝孢酵母的生长和油脂积累都有显著的促进作用，与添加量和时间密切相关．添加醋酸泼尼松100 mg/L，可以有效促进菌体的生长，使皮状丝孢酵母生物量达到最大，比未添加醋酸泼尼松提高68%；一次添加醋酸泼尼松200 mg/L，对皮状丝孢酵母油脂积累油脂最为明显，可以提高98%的产量．如果采用分批添加醋酸泼尼松至200mg/L，即30 h前使添加醋酸泼尼松维持100 mg/L，30 h后补加醋酸泼尼松，维持在200 mg/L，微生物油脂产量可以从最初2.5 g/L提高到5.7 g/L，共提高128%，通过气相检测发现酵母油脂脂肪酸的组成含量也发生了变化，油酸、亚油酸含量分别增加21.6%、32.3%．本文对提高皮状丝孢酵母生物量和油脂积累提供了一种新的方法．本课题组还通过添加甾体激素类醋酸地塞米松、氢化可的松、氟米松等实验对皮状丝孢酵母生长和油脂积累情况进行了考察，实验表明均有一定程度促进作用，后期对甾体激素促进皮状丝孢酵母产油脂的内在机理和工艺需要进一步优化．

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