电针通过抑制AQP4表达减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠脑水肿损伤及星形胶质细胞激活*

卞炜，秦文熠（.重庆市永川区中医院康复科4060；.重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 40006）

脑水肿损伤是缺血性脑血管疾病潜在的一种严重并发症[1]，而脑水肿是引发大面积脑梗死高死亡率和高致残率的重要原因[2]。研究表明，水通道蛋白4（AQP4）是中枢神经系统最主要的水通道蛋白，广泛存在于星形胶质细胞[3]，其在脑缺血所致脑水肿的发病机制中占据着重要地位[4]。星形胶质细胞作为中枢神经系统的主要支持成分，在脑缺血发生后，过度激活的星形胶质细胞可通过释放谷氨酸[5]、促炎性细胞因子诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）等[6]分泌加重再灌注损伤。研究表明，AQP4不仅可介导星形胶质细胞调节水在脑、血管和脑室之间的交换，还参与了脑缺血发生后星形胶质细胞的激活[7-8]。针刺作为中国传统的非药物治疗手段，对脑缺血/再灌注炎性损伤具有显著的临床效应[9]，但其抗炎机制尚不明确。本研究着重探讨电针能否通过调节AQP4的表达减轻脑水肿及星形胶质细胞活化，以期深入探讨电针治疗减轻局灶脑缺血/再灌注后脑损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠60只，体重250～300 g，由重庆医科大学动物中心[SCXK（渝）2012-0002]提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 AQP4多克隆抗体（Abcam公司）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体（Abcam公司）、免疫荧光定量PCR相关试剂（Takara公司）、AQP4、GFAP引物（上海生物生工有限公司合成）、G6850型电针治疗仪（北京精工仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立 将60只大鼠分为正常组（NC组）、模型组（tMCAO组）、模型+电针治疗组（EA组）、模型+电针+AQP4特异性拮抗剂TGN-02组（TGN-02组），每组15只。采用改良线栓法[10-11]规范化制备大鼠右侧大脑中动脉缺血/再灌注模型，缺血时间为90 min。TGN-02组大鼠于造模前腹腔注射AQP4特异性拮抗剂TGN-02，剂量为 200 mg/kg[12]。

1.2.2 电针刺激 EA组与TGN-02组参照中国针灸学会实验针灸委员会实验动物穴位图谱，选取大鼠“百会”穴及左侧“四关”穴为电针穴位，电针频率为2/20 Hz，波型为疏密波，强度以大鼠肢体轻微震颤为宜。EA组与TGN-02组首次电针刺激于再灌注后1 h进行，刺激时间每次20 min，每天治疗1次。

1.2.3 主要检测指标及方法

1.2.3.1 脑组织含水量检测 再灌注后24 h，采用干湿法测定脑组织含水量。准确称取右侧脑组织湿重，后置于100～110℃烤箱中烘干24 h以上至恒重，称取脑干重。脑组织含水量百分比=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.2.3.2 Western blotting检测AQP4蛋白的表达 取大脑皮质缺血区脑组织约50 mg入蛋白裂解液，充分匀浆后静置半小时，4℃12 000 r/min离心15 min，取上清液。BCA蛋白定量法检测上清液浓度。用4×上样缓冲液将蛋白稀释成相同浓度，-80℃保存。以50µg样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）电泳，然后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭60 min，孵育 AQP4一抗（稀释比例为 1∶2 000），4℃过夜，孵育二抗（稀释比例为1∶5 000）1 h，ECL凝胶成像仪显影，采用软件Fusion进行灰度值分析。

1.2.3.3 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测AQP4、GFAP mRNA的表达 按Takara说明书提取大鼠大脑缺血区皮质总RNA，后将总RNA逆转录为20µL cDNA。AQP4 mRNA 的上游引物 5′-AGATCAGCATCGCCAAGTCTCT-3′，下游引物为 5′-AGTGAGGTTCCAT-3′；GFAP mRNA 的上游引物 5′-AGTGGTATCGGTCCAAGTTTG-3′，下游引物为 5′-GTTGGCGATAAGTCATTAC-3′；β-actin mRNA 的上游引物 5′-ACGGTCAGGTACTCACTATCG-3′，下游引物为 5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′。

1.2.3.4 免疫荧光检测GFAP的表达 将冰冻切片采用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100）室温孵育30 min，5%山羊血清 37℃封闭1 min，加GFAP一抗（稀释比例 1∶100），4℃过夜，第 2天 37℃复温 1 h，荧光二抗 37 ℃孵育 60 min，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）37℃孵育10 min，50%甘油封片。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据处理，所有数据以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，多组间进一步比较采用LSD检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑水肿情况比较 再灌注后24 h，tMCAO组大鼠出现明显脑水肿，EA组脑水肿较tMCAO组明显减轻，TGN-02组脑水肿较EA组明显加重，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组脑水肿情况比较

2.2 各组大鼠大脑缺血皮质区AQP4蛋白及mRNA表达情况 Western blotting结果显示，NC组有少量AQP4蛋白表达。tMCAO组和EA组AQP4蛋白表达均高于NC组，EA组AQP4表达明显低于tMCAO组，TGN-02组AQP4表达明显低于EA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。RT-qPCR 结果显示，AQP4 mRNA 表达规律与蛋白表达规律一致，NC组表达很弱，EA组较tMCAO 组明显减少（P＜0.05），TGN-02处理后，AQP4 mRNA 水平进一步降低（P＜0.05）。见图2、3。

图2 各组SDS-PAGE电泳图

图3 各组AQP4蛋白及mRNA表达情况比较

2.3 各组大鼠大脑缺血皮质区GFAP mRNA表达情况 RT-qPCR结果显示，tMCAO组GFAP mRNA表达较NC组明显升高，EA组较tMCAO组明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）；阻断APQ4作用后，电针治疗未能下调 GFAP mRNA表达（P＜0.01）。见图4。

图4 各组GFAP mRNA表达情况比较

2.4 各组大鼠大脑缺血皮质区GFAP标记的星形胶质细胞比较 荧光共聚焦结果显示，NC组星形胶质细胞突起细长，分支较少，tMCAO组星形胶质细胞胞体肥大、肿胀、突起增多。EA组星形胶质细胞数量较tMCAO组明显减少。TGN-02作用被阻断后，电针治疗未能削弱星形胶质细胞活化。见图5。

图5 各组GFAP阳性星形胶质细胞活化情况（400×）

3 讨 论

在中枢神经系统中表达的几个水通道中，AQP4被认为是治疗脑肿瘤、创伤性脑损伤、脑积水和神经炎症等脑部疾病的一个很有治疗前景的靶点[13-16]。AQP4不仅是脑内一种特异性的水转运孔道，还参与维持脑内微环境、调节神经传导、诱导神经再生和自身免疫的应答等病理生理反应。

脑内与毛细血管、蛛网膜和软脑膜直接接触的星形胶质细胞所组成的胶质界膜的致密星形足突是AQP4的主要表达区域[17-18]。血管周围的星形细胞足突是AQP4高表达的区域[19-20]。研究表明，AQP4参与了星形胶质细胞调节脑、血管和脑室之间水的交换及脑缺血发生后星形胶质细胞的激活。MANLEY等[21]发现，AQP4基因敲除小鼠较野生型小鼠行tMCAO术后存活率高，且AQP4基因敲除的小鼠星形胶质细胞周围毛细血管肿胀程度及脑水肿与野生型小鼠相比明显减轻。THRANE等[22]研究显示，AQP4的缺失可减弱星形胶质细胞钙离子信号，从而减弱AQP4表达增高诱导的星形胶质细胞肿胀、活化。AQP4基因敲除小鼠的星形胶质细胞的增殖、再激活和胶质瘢痕形成受到明显抑制[8]，过表达AQP4可促进细胞黏附、新的屏障和胶质界膜形成[9]。

研究表明，电针治疗可下调脑缺血/再灌注损伤后脑内AQP4表达。任清潇等[23]发现，再灌注后24 h，电针可下调因脑缺血而诱导的AQP4表达升高，且血管周边AQP4分布减少。有研究表明，电针治疗能明显减轻血-脑屏障的破坏，减轻脑水肿，减少IgG外渗，降低AQP4和金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，且AQP4和MMP-9的变化有显著相关性，推测电针对脑再灌注后血-脑屏障损伤的保护作用可能与其调节AQP4表达有关[24-25]。陈春芳等[26]也有相同的发现。尽管大量研究表明，电针治疗可下调AQP4表达，减轻脑水肿，但电针治疗减轻脑水肿的机制是否与下调AQP4相关？还是这仅是一种脑缺血后的伴随现象？在目前的研究中尚无定论，基于此，本研究采用腹腔注射TGN-02特异性阻断AQP4表达，观察电针治疗后脑水肿情况是否同单纯电针治疗组一样得到改善。结果表明，AQP4作用被阻断后，电针治疗减轻脑水肿的作用明显减弱，从而证实了电针确实可以通过调节AQP4表达，减轻脑水肿。在证实电针可以通过下调AQP4表达减轻脑水肿损伤后，本课题进一步探讨，该作用是否与减轻星形胶质细胞的活化有关，结果发现，当阻断AQP4作用后，电针治疗并不能明显削弱星形胶质细胞的活化，表明了电针治疗减轻脑缺血诱导的星形胶质细胞的活化与其下调AQP4有关。

本研究从电针减轻脑缺血/再灌注后脑水肿为切入点，特色之处在于采用腹腔注射AQP4抑制剂，观察脑水肿改善情况，并同时检测脑内星形胶质细胞的活化情况。研究结果表明，电针可通过下调AQP4表达，减轻脑水肿和脑缺血诱导的星形胶质细胞的活化，为电针在临床上治疗脑梗死提供了进一步的理论依据。

[1]BEHROUZIFAR S，VAKILI A，BANDEGI AR，et al.Neuroprotective nature of adipokine resistin in the early stages of focal cerebral ischemia in a stroke mouse model[J].Neurochem Int，2018，114：99-107.

[2]KIMBERLY WT，DUTRA BG，BOERS AMM，et al.Association of reperfusion with brain edema in patients with acute ischemic stroke:a secondary analysis of the MR CLEAN trial[J/OL].JAMA Neurol，2018-01-24[2018-03-01].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kimberly+WT%2C+Dutra+BG%2C+Boers+AMM%2C+et+al.+Association+of+Reperfusion+With+Brain+Edema+in+Patients+With+Acute+Ischemic+Stroke%3A+A+Secondary+Analysis+of+the+MR+CLEAN+Trial.

[3]PIRICI I，BALSANU TA，BOGDAN C，et al.Inhibition of aquaporin-4 improves the outcome of ischaemic stroke and modulates brain paravascular drainage pathways[J].Int J Mol Sci，2017，19（1）：pii：E46.

[4]PAPADOPOULOS MC，VERKMAN AS.Aquaporin-4 and brain edema[J].Pediatr Nephrol，2007，22（6）：778-784.

[5]REN ZY，YU XQ，PENG SQ.The imbalance of calcium homeostasis in excitotoxicity and its role in the degenerative lesions[J].Chin Pharmacol Bull，2007，23（3）：289-292.

[6]梅和珊，王永利.脑缺血时谷氨酸释放机制[J].中国药理学通报，2005，21（4）：393-396.

[7]LIU L，LU Y，HU G，et al.Aquaporin-4 deficiency exacerbates brain oxidative damage and memory deficits induced by long-term ovarian hormone deprivation and D-galactose injection[J].Int J Neuropsychopharmacol，2012，15（1）：55-68.

[8]BADAUT J，ASHWAL S，OBENAUS A.Aquaporinsin cerebrovascular disease：a target for treatment of brain edema?[J].Cerebrovas Dis，2011，31（6）：521-531.

[9]QIN WY，LUO Y，CHEN L，et al.Electroacupuncture could regulate the NF-κB signaling pathway to ameliorate the inflammatory injury in focal cerebral ischemia/reperfusion model rats[J].Evid Based Complement Alternat Med，2013：924541.

[10]KLEINSCHNITZ C，POZGAJOVA M，PHAM M，et al.Targeting platelets in acute experimental stroke：impact of glycoprotein Ⅰb，Ⅳ，andⅡb/Ⅲa blockade on infarct size，functional outcome，and intracranial bleeding[J].Circulation，2007，115（17）：2323-2330.

[11]KARELINA K，NORMAN GJ，ZHANG N，et al.Social isolation alters neuroinflammatory response to stroke[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（14）：5895-5900.

[12]IGARASHI H，HUBER VJ，TSUJITA M，et al.Pretreatment with a novel aquaporin 4 inhibitor，TGN-020，significantly reduces ischemic cerebral edema[J].Neurol Sci，2011，32（1）：113-116.

[13]ZHAO J，MOORE AN，CLIFTON GL，et al.Sulforaphane enhances aquaporin-4 expression and decreases cerebral edema following traumatic brain injury[J].J Neurosci Res，2005，82（4）：499-506.

[14]FRYDENLUND DS，BHARDWAJ A，OTSUKA T，et al.Temporary loss of perivascular aquaporin-4 in neocortex after transient middle cerebral artery occlusion in mice[J].ProcNatl Acad Sci USA，2006，103（36）：13532-13536.

[15]MIYAMOTO K，NAGAOSA N，MOTOYAMA M，et al.Upregulation of water channel aquaporin-4 in experimental autoimmune encephalomyeritis[J].J Neurol Sci，2009，276（1/2）：103-107.

[16]LI L，ZHANG H，VARRIN-DOYER M，et al.Proinflammatory role of aquaporin-4 in autoimmune neuroinflammation[J].FASEB J，2011，25（5）：1556-1566.

[17]KIMELBERG HK，GODERIE SK，HIGMAN S，et al.Swellinginduced release of glutamate，aspartate，and taurine from astrocyte cultures[J].J Neurosci，1990，10（5）：1583-1591.

[18]RUTLEDGE EM，ASCHNER M，KIMELBERG HK，et al.Pharmacological characterization of swelling-induced D-[3H]aspartate release from primaryastrocytecultures[J].AmJPhysiol，1998，274（6Pt1）：C1511-1520.

[19]BLOCH O，PAPADOPOULOS MC，MANLEY GT，et al.Aquaporin-4 gene deletion in mice increases focal edema associated with staphylococcal brain abscess[J].J Neurochem，2005，95（1）：254-262.

[20]AMIRY-MOGHADDAM M，XUE R，HAUG FM，et al.Alpha-syntrophin deletion removes the perivascular but not endothelial pool of aquaporin-4 at the blood-brain barrier and delays the development of brain edema in an experimental model of acute hyponatremia[J].FASEB J，2004，18（3）：542-544.

[21]MANLEY GT，FUJIMURA M，MA T，et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J].Nat Med，2000，6（2）：159-163.

[22]THRANE AS，RAPPOLD PM，FUJITA T，etal.Criticalrole of aquaporin-4（AQP4）in astrocyte Ca2+signaling eventselicited by cerebral edema[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（2）：846-851.

[23]任清潇，杨帆，彭拥，等.电针影响大鼠脑缺血再灌注后水通道蛋白4（AQP4）的表达及其在血管周边的分布[J].复旦学报（医学版），2012，39（6）：594-599.

[24]彭拥军，陈理，姚文龙，等.电针抗脑缺血再灌注后AQP4介导的血脑屏障损伤的作用研究[J].南京中医药大学学报，2010，26（6）：425-427.

[25]彭拥军，周飞，顾靖，等.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠水通道蛋白-4 的调节作用[J].针刺研究，2007，32（2）：83-87.

[26]陈春芳，舒遵华，张立新.电针对缺血再灌注大鼠脑水肿及水通道蛋白-4 的影响[J].中国老年学杂志，2009，29（14）：1790-1791.