沙利度胺对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其机制

敖曼，冯文凯，肖旭，敖亚洲

(承德医学院附属医院，河北承德067000)

沙利度胺是一种谷氨酸衍生物，其包含左旋和右旋异构体的消旋体，主要作用为调节免疫、抗血管生成、调节细胞因子表达、增强化疗效果及调节细胞凋亡、黏附与迁移[1～3]。目前沙利度胺已用于Kaposi肉瘤、卵巢癌、恶性黑色素瘤等的治疗[4，5]；但用于治疗肝癌的报道鲜见，其对肝癌细胞增殖、凋亡的影响尚不明确。B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)是细胞凋亡基因的调控者；Bcl-2为抗凋亡蛋白，其同源二聚体Bcl-2相关X蛋白(Bax)为促调亡蛋白[6]。当Bcl-2/Bax发生变化时，线粒体通透性改变，细胞色素、调亡诱导因子等可溶性膜间隙蛋白被释放，启动Caspase级联反应参与细胞凋亡[7，8]。沙利度胺对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制尚不明确。2017年2～10月，本研究观察了沙利度胺体外对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌HepG2细胞株(中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库)。DMEM 培养基(赛默飞世尔科技中国有限公司)，胰酶(美国Gibco公司)，FBS(武汉普诺赛生命科技有限公司)，TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒(碧云天生物技术公司产品)。BAX和Bcl-2基因表达测定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(宝生物工程大连有限公司)，BAX和Bcl-2 蛋白ELISA试剂盒(碧云天生物技术公司产品)。实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)，NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)，HBS-1096B 酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)，DnJ--4249 CO2培养箱(美国REVCO公司)，恒温培养箱grp-9080(美国通用公司)，二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技中国有限公司)，超净工作台(上海恒跃医疗器械有限公司)。

1.2 细胞分组及沙利度胺干预 将装有HepG2细胞株的冻存管从液氮中取出，37 ℃水浴箱迅速解冻，无菌吸管吸取菌液至5 mL EP无菌管中，1 500 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入含10% FBS、链霉素100 μg/mL、青霉素100 μg/mL的RPMI-1640培养基(pH值7.2)至总体积5 mL，置37 ℃、5% CO2培养箱培养，3天换液，当细胞融合率达到80%时收集细胞。将细胞分为对照组和观察1、2、3组，每组6管，每管10 mL,含细胞约5×106个。对照组常规培养不加药；观察1、2、3组分别加入终浓度为0.50、1.00、2.00 μg/mL的沙利度胺，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养72 h。

1.3 相关指标观察

1.3.1 细胞增殖情况 采用MTT法。取各组细胞接种于96孔板，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)10 μL,37 ℃继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL DMSO,振荡15 min,使结晶物充分溶解，采用酶标仪于490 nm波长处测定光密度(OD)值。

1.3.2 细胞凋亡情况 取各组细胞接种于96孔板，加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS 漂洗，加入Hoechst33258染色液避光染色 5 min , PBS 漂洗,抗荧光淬灭封片液封片,荧光显微镜观察并拍照。采用Image J软件测算各组荧光强度。

1.3.3 细胞Bcl-2、Bax mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法。TRIzol法提取RNA，逆转录为cDNA。从GenBank 数据库获取Bcl-2、Bax基因序列，设计引物。Bcl-2正向引物5′-GGAGACATGAGAGCTGCCAAC-3′，反向引物5′-CCAGCAGCATGTCGAAGATC-3′，扩增片段长度260 kb；Bax正向引物5′-TGTCCATGAGAGCTCAGCA-3′，反向引物5′-TCGTACAGCATGTCGAATGCC-3′，扩增片段长度262 kb；内参照β-actin正向引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，反向引物5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，扩增片段长度259 kb。反应条件95 ℃ 5 min; 93 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s，重复 40个循环。用2-ΔΔCt法计算Bcl-2、Bax mRNA相对表达量。

1.3.5 细胞培养液上清液Bcl-2 、Bax 蛋白水平 收集各组细胞培养液上清液，离心纯化，采用ELISA法检测上清液Bcl-2 、Bax 蛋白。按试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况比较 对照组及观察1、2、3组细胞OD490分别为1.59±0.01、1.13±0.03、0.79±0.02、0.51±0.04。观察1、2、3组细胞均低于对照组(P均<0.05)；观察1、2、3组细胞OD490依次降低，两两比较P均<0.05。

2.2 各组细胞凋亡情况比较 对照组正常HepG2细胞在紫外线激发下呈均匀的蓝色荧光，淡染；从观察1组到观察3组，随着沙利度胺剂量的增加, HepG2细胞数明显减少，细胞核出现不同程度的皱缩、破裂，发出较强的蓝白色荧光；同一细胞内出现形状不规则颗粒状、大小不等的多个凋亡小体。对照组、观察1组、观察2组、观察3组细胞荧光强度分别为0.13±0.01、1.08±0.04、1.89±0.09、3.55±0.14。荧光强度：对照组<观察1组<观察2组<观察3组(P均<0.05)。

2.3 各组细胞Bcl-2、Bax mRNA相对表达量比较 Bcl-2 mRNA相对表达量：对照组>观察1组>观察2组>观察3组(P均<0.05)，Bax mRNA相对表达量：对照组<观察1组<观察2组<观察3组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组Bcl-2 、Bax mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05； 与观察1组比较，#P<0.05；与观察2组比较，△P<0.05。

2.4 各组细胞培养液上清液Bcl-2 、Bax 蛋白表达比较 细胞培养液上清液Bcl-2蛋白表达：对照组>观察1组>观察2组>观察3组(P均<0.05)，Bax蛋白表达：对照组<观察1组<观察2组<观察3组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组细胞培养液上清液Bcl-2 、Bax 蛋白水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05； 与观察1组比较，#P<0.05；与观察2组比较，△P<0.05。

3 讨论

沙利度胺最早用于镇静剂以及缓解由于早孕引起的乏力、恶心等症状。目前关于沙利度胺的抗肿瘤作用尚处于基础研究或早期的临床试验阶段，但已引起临床极大关注并显示出极大的潜力。国内外的研究表明，沙利度胺具有一定的抑瘤效应，其机制可能与抑制肿瘤血管生长、诱导肿瘤细胞凋亡等有关。目前沙利度胺已经成为复发和难治多发性骨髓瘤标准治疗的一部分，对骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征的治疗值得期待，与其他药物联用对卡波西肉瘤、结肠癌、肾癌、卵巢癌等的治疗也有一定效果，但沙利度胺具体的抗肿瘤作用机制迄今仍不是很明确。

肿瘤的发生不仅与癌基因的激活以及抑癌基因的突变或者缺失有关，还可能与细胞凋亡以及增殖失衡有关，控制肿瘤细胞增殖是治疗肿瘤的关键。 Bcl-2 基因家族包括抑制细胞凋亡类(如 Bcl-2、Bcl-xl、ced-9)及促进细胞凋亡类(如 Bax、BaK、Bad、Bcl-xs)，两类基因在细胞凋亡过程中具有重要的调控作用。有报道，Bax表达低下或缺失参与了胆管癌的发生、发展过程[9]。

杨蕾等[10]研究发现，Bcl-2家族蛋白在程序性细胞死亡中起关键作用，其通过抑制细胞凋亡、延长细胞生存而参与肿瘤发生。目前研究发现，Bcl-2家族蛋白可以分成两类[11～13]。一类是抑制细胞凋亡蛋白，主要为Bcl-2亚家族。Bcl-2 蛋白主要分布在线粒体外膜、核膜等处，存在于造血细胞及多种肿瘤细胞中。脓毒症小鼠Bcl-2 过表达与Bcl-2 表达低下者比较，细胞凋亡减少，免疫细胞存活时间延长，生存率较高。体外实验发现，Bcl-2 基因可抑制多种刺激导致的多种细胞凋亡[14，15]。目前认为Bcl-2 抗凋亡的机制主要包括阻止细胞色素C 激活Caspase、抑制促凋亡蛋白质细胞色素C 自线粒体释放到胞质内、对抗促凋亡基因Bax、抗氧化等作用。第二类是促进细胞调亡蛋白，主要为Bax亚家族。Bcl-2和Bax可彼此形成异二聚体或与自身形成同源二聚体，对Bcl-2 产生抑制作用。普遍认为Bcl-2和Bax两蛋白之间的比例关系是决定细胞凋亡水平的关键因素之一[16]。研究发现，Bcl-2和Bax通过其BH3结构域与Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成异二聚体Bcl-2/Bax，使细胞不进入凋亡程序[17]；当Bax蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，可诱导细胞凋亡；当Bcl-2蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，可抑制细胞调亡。Bcl-2阳性表达在胃癌中主要表现在细胞质或细胞膜上，且与有无淋巴结转移存在明显相关[18]。随着胃癌的临床分期增加、浸润深度加深，Bcl-2 表达有增强的趋势。Bcl-2 在胃癌组织中的表达与肿瘤的分化程度与临床分期相关[19～22]。杨闯等[23]研究结果显示，Bcl-2 过表达参与了肝癌的发生、发展及转移等过程。

本研究结果显示，观察1、2、3组细胞OD490均低于对照组，且观察1、2、3组细胞OD490依次降低，表明沙利度胺可以剂量依赖性的抑制肝癌HepG2细胞增殖。对照组正常HepG2细胞在紫外线激发下呈均匀的蓝色荧光，随着沙利度胺剂量的增加, HepG2细胞数明显减少，细胞核出现不同程度的皱缩、破裂，发出较强的蓝白色荧；同一细胞内可出现形状不规则颗粒状、大小不等的多个凋亡小体细胞，显示细胞凋亡的特征，且荧光强度对照组<观察1组<观察2组<观察3组，说明沙利度胺能够诱导HepG2细胞凋亡，且具有剂量-效应关系。本研究细胞Bcl-2 mRNA相对表达量和细胞培养上清液Bcl-2蛋白表达对照组>观察1组>观察2组>观察3组，细胞Bax mRNA相对表达量和细胞培养液上清液Bax蛋白表达对照组<观察1组<观察2组<观察3组。说明沙利度胺能抑制HepG2细胞Bcl-2 mRNA、蛋白的表达，促进HepG2细胞Bax mRNA、蛋白的表达，这可能是沙利度胺诱导HepG2细胞凋亡、抑制HepG2细胞增殖的机制，与杨闯等[23]的研究结果一致。

综上所述，沙利度胺能抑制Bcl-2 mRNA、蛋白表达，促进Bax mRNA、蛋白的表达，进而诱导HepG2细胞凋亡，且具有明显的剂量-效应关系。

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