白血病抑制因子受体在宫颈癌肺转移过程中的作用及其机制

贺丹，刘海凤，蒋欣妮

(1 核工业四一六医院，成都 610057；2 成都医学院生物医学系)

宫颈癌转移早期主要表现为淋巴结转移，后期以肺转移为主[1～3]。研究发现，白血病抑制因子受体(LIFR)与多种恶性肿瘤的复发和转移密切相关，如肝癌、黑色素瘤等[4～6]。LIFR可通过靶向河马-转录共激活因子YES相关蛋白(Hippo-YAP)信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭转移[7]，其机制是LIFR与白血病抑制因子(LIF)相互作用，活化下游信号通路，如Hippo-YAP信号通路等[8，9]。LIFR是Hippo级联信号通路的开启者，LIF通过与其受体LIFR结合，作用于Hippo激酶从而抑制YAP的磷酸化，减少磷酸化YAP(pYAP)的生成，增加YAP的活化，参与下游基因转录及细胞内信号通路调控[10，11]。据此我们推测LIFR可通过调控Hippo-YAP而抑制宫颈癌细胞的肺转移。本研究探讨LIFR在宫颈癌肺转移中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选取50例宫颈癌肺转移患者(年龄35～70岁，2016年1～5月于我院手术治疗)的原发灶癌组织及其癌旁组织、肺转移灶癌组织(来自支气管镜肺组织活检或经皮肺组织活检)。患者术前均未进行放疗或化疗。细胞株、实验动物及试剂：人宫颈癌细胞株 SiHa采用DMEM培养基培养(添加10%胎牛血清)，置于37 ℃、饱和湿度、含5% CO2细胞培养箱内孵育。4周龄雌性BALB/c裸鼠10只，购自广东省医学实验动物中心。兔抗人LIFR、pYAP、pTAZ和GAPDH抗体(CST，USA)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(博士德，武汉)，表达LIFR的重组慢病毒质粒及其阴性对照vector(GeneCopoeia，USA)，Lipofectamine 2000转染试剂和TRIzol试剂(Invitrogen，USA)，蛋白提取试剂盒、ECL增强化学发光试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒(Thermo，USA)，RNA抽提试剂盒(Applied Biosystems，USA)，TaqMan逆转录试剂盒 (Life Technologies, UK)，qSYBR-Green-containing PCR试剂盒(Qiagen, USA)，免疫组化(SP法)检测试剂盒(沈阳，万类生物科技)。

1.2 原发灶癌组织、癌旁组织及肺转移灶癌组织LIFR mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。采用TRIzol提取RNA，操作按试剂盒说明书进行。以提取的总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明书操作逆转录获得cDNA，以cDNA为模板，按qSYBR-Green-containing PCR试剂盒说明书进行操作。以GAPDH为内参照。LIFR、GAPDH引物由Invitrogen公司设计、合成。采用2-ΔΔCT法计算LIFR mRNA相对表达量。

1.3 过表达LIFR的SiHa细胞LIFR、Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达及其肺转移能力观察

1.3.1 过表达LIFR的SiHa细胞构建 收集SiHa细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释，吹打制成1×105个/mL的细胞悬液，6孔板中每孔铺2 mL细胞，置于细胞培养箱中。细胞汇合度达80%左右时分为观察组和对照组，每组3孔，分别转染LIFR重组慢病毒质粒和对照转染空载体质粒(均带EGFP荧光标签)。转染方法：用无菌EP管配制Lipofectamin 2000和转染试剂(LIFR重组慢病毒质粒或空载体质粒)，混匀并室温放置20 min。将上述混合物加入到无血清培养液(不含抗生素)中混匀，加入到待转染的6孔中；置于培养箱中，6 h后换成常规培养基。观察组3天后观察荧光强度，并加入2.0 μg/mL嘌呤霉素继续培养，直到所有细胞可观察到荧光。

1.3.2 过表达LIFR的SiHa细胞LIFR及Hippo-YAP信号通路相关蛋白YAP、P-YAP、TAZ、p-TAZ蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取观察组和对照组细胞总蛋白：PBS缓冲液冲洗细胞2次，吸干残留液后每皿加1 mL的RIPA蛋白裂解液，反复晃动培养皿3～5 min，使裂解液与细胞充分接触；然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集到1.5 mL离心管中，置于冰中摇床上缓慢摇动30 min使细胞完全裂解，12 000 r/min离心5 min后收集上清液，得细胞总蛋白，BCA法测定各组细胞的蛋白浓度。取30 μg蛋白样本在10% SDS-PAGE凝胶上电泳。将蛋白转移至PVDF膜上，5% BSA室温封闭1～2 h，加入1∶5 000的兔抗人LIFR、YAP、pYAP、TAZ、pTAZ和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶2 000的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL发光剂并用X线曝光、显影、定影、扫描并保存条带图像。用Quantity One软件分析图像，以目的蛋白条带灰度值和内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.3.3 过表达LIFR的SiHa细胞的肺转移能力观察 将10只4周龄雌性BALB/c裸鼠分为A、B组，各5只，分别尾静脉注射观察组和对照组细胞悬液100 μL，含细胞1×105个。4周后处死裸鼠并解剖，取出肺组织，HE染色，镜下统计肺组织中所有转移灶的个数[12]。该实验的所有操作符合动物伦理学。

2 结果

2.1 原发灶癌组织、癌旁组织及转移灶癌组织LIFR mRNA表达 原发灶癌组织、癌旁组织及转移灶癌组织LIFR mRNA相对表达量分别为1.04±0.33、0.63±0.15、0.87±0.16，转移灶组织LIFR mRNA相对表达量低于原发灶癌组织和癌旁组织(P均<0.05)，原发灶癌组织LIFR mRNA相对表达量低于癌旁组织(P<0.05)。

2.2 过表达LIFR的SiHa细胞LIFR、YAP、p-YAP、TAZ、p-TAZ蛋白表达及肺转移能力

2.2.1 LIFR、YAP、p-YAP、TAZ、p-TAZ蛋白表达 观察组LIFR、p-YAP、p-TAZ蛋白相对表达量高于对照组(P均<0.05)；两组YAP、TAZ蛋白表达量比较无统计学差异，P均>0.05。见表1。

表1 两组LIFR、YAP、p-YAP、TAZ、p-TAZ蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2.2 肺转移能力 尾静脉注射细胞后4周，A、B组肺转移灶分别为(9±2)、(60±3)个，二者相比，P<0.05。

3 讨论

研究显示，LIFR在多种肿瘤组织中存在表达失调的现象，如在乳腺癌组织中表达缺失，且与乳腺癌的淋巴结阳性状态、肿瘤分级、远处转移风险及总体生存期密切相关[13]。pYAP的表达异常也存在于多种肿瘤组织中，并与临床进程及病理指标相关，如结肠癌组织pYAP表达与Ki-67、pERK表达相关[14]，食管鳞癌组织pYAP表达与患者临床病理参数密切相关[15]。本研究结果显示，LIFR在宫颈癌原发灶和转移灶中均存在低表达现象，且在转移灶中表达水平最低。该结果与多种恶性肿瘤如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等组织中存在LIFR表达失调的结果[8，9，11]一致。

本研究构建了过表达LIFR的宫颈癌SiHa细胞株并将其注射于裸鼠体内，结果4周后裸鼠肺组织转移灶数目明显少于注射对照组SiHa细胞者。证实LIFR有抑制宫颈癌转移的作用，与已有研究LIFR可抑制肝癌和乳腺癌转移的结果一致[4，5]。

为探究LIFR抑制宫颈癌转移的分子机制，本研究观察了过表达LIFR对Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达的影响，发现LIFR过表达可显著上调pYAP和pTAZ的蛋白表达，即LIFR过表达可导致YAP和TAZ被磷酸化，YAP和TAZ失活。已有研究证实YAP在肿瘤中发挥癌基因的作用，可通过增强转录因子的活性而促进相关基因表达，在Hippo信号通路中扮演着极其重要的效应因子角色[16]。YAP会因为被磷酸化而失去调控活性[17]。序列分析结果显示，具有PDZ结合序列的转录共活化因子(TAZ)与YAP同源, 其功能和表达与YAP类似，均具有14-3-3结合域，同时YAP和TAZ均具有WW 结构域，两者的磷酸化位点也具有相似性，均为S89。YAP和TAZ均在磷酸化后产生14-3-3的结合位点，使YAP和TAZ 转位到细胞质中，产生功能性失活[18]。SiHa细胞过表达LIFR可导致pYAP和pTAZ的蛋白表达量显著增加，YAP和TAZ磷酸化而失活，导致下游相关信号通路的抑制。Hippo-YAP信号通路失调可打破肿瘤细胞增殖和凋亡平衡，YAP的过度活化可使组织器官的体积异常增加，其失活则会使组织器官的体积显著缩小，YAP和TAZ的活化可促进肿瘤细胞的侵袭和转移，YAP和TAZ磷酸化失活则可抑制肿瘤细胞的侵袭转移[19]。YAP和TAZ的生物活性由其在细胞内的定位所决定, pYAP和14-3-3蛋白特异性结合而富集于胞质中使YAP和TAZ失去活性，剩余的非磷酸化的YAP和TAZ则在细胞核中聚集，通过与转录激活相关因子的特异性结合，开启下游相关基因转录[20]。另有研究显示，YAP与干细胞的干性维持、自我更新和多向分化功能密切相关。目前已在多种功能的干细胞中发现YAP和TAZ的表达上调且发挥维持干性的功能，如胚胎、神经和造血干细胞等。Sox2-YAP-Hippo途径是维持干细胞自我更新、促进肿瘤细胞转移、耐药和休眠的重要调控通路[21]。作为癌基因的YAP是Hippo信号通路的下游信号分子，其在前列腺癌中可促进前列腺上皮细胞的迁移，使上皮细胞向恶性肿瘤细胞转化[22]； 可促进胃癌的发生、侵袭及转移过程[23]；与肝癌细胞的浸润转移密切相关；且与肝癌患者较差的临床预后有关。关于LIFR调控Hippo-YAP抑制肿瘤细胞肺转移的作用多篇研究已做了详细报道[11，24]。

综上所述，宫颈癌组织中LIFR表达下调。过表达LIFR可显著上调SiHa细胞中LIFR、pYAP和pTAZ表达，抑制宫颈癌细胞的体内转移能力，该过程可能是通过LIFR抑制Hippo-YAP信号通路而实现的。下一步拟研究在宫颈癌细胞系中LIFR对Hippo-YAP信号通路发挥调控作用的具体作用位点和调控方式，深入探究其分子机制。

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