丁胱亚磺酰亚胺对正常肝细胞的毒性作用及其机制探讨

王圆，关溯

(华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006)

丁胱亚磺酰亚胺(BSO)在肿瘤临床治疗中常用作化疗和放疗增敏剂，其作用机制是通过抑制肿瘤细胞γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶减少谷胱甘肽的合成，降低细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)水平，增加细胞对辐射或某些化学药物的敏感性[1]。但BSO对正常肝细胞是否会产生明显的毒性作用尚不明确。2016年9～12月，本研究观察了BSO对人正常肝细胞的毒性，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胚肝细胞株L-02购自中国科学院上海生物化学细胞所细胞库，用RPMI 1640培养基(含10%新生小牛血清，青霉素100 kU/L和链霉素100 kU/L)，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco-BRL生物技术公司；新生小牛血清购自杭州四季青公司；p38磷酸化蛋白及总蛋白抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔二抗购自美国Jackson Immuno Research公司；BSO、噻唑蓝(MTT)、台盼蓝、GSH、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、2-vinylpyridine、5,5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸) (DTNB)及谷胱甘肽还原酶购自美国Sigma公司；SB203580购自美国Alexis Biochemicals公司；硝酸纤维素膜及预染的标准蛋白分子购自美国Bio-Rad公司；化学发光检测系统购自美国Amersham Pharmacia Biotech生物技术公司；蛋白电泳、转膜仪及其电源购自美国Bio-Rad公司；Spectramax 190酶标仪购自美国Molecular Device公司；荧光探针H2DCFDA购自美国Life Technology 公司。

1.2 BSO对L-02细胞存活率影响的观察 采用 MTT法。将L-02细胞铺入96孔板，密度104个/孔，12 h后待细胞贴壁生长状态良好时，加入终浓度分别为0、10、25、50、100和200 μmol/L的BSO，孵育48 h后加入10 μL MTT溶液反应4 h。再加入三联剂(10% SDS-5%异丁醇-0.01 mol/L HCl)，置于37 ℃培养箱中溶解12 h以上，分别测定570 nm和630 nm处的吸光值，按以下公式计算细胞存活率：存活率=[(实验孔OD570-实验孔OD630)/(对照孔OD570-对照孔OD630)]×100%。

1.3 BSO对L-02细胞GSH含量影响的观察 将L-02细胞铺入60 mm培养皿，密度106个/皿，12 h后待细胞贴壁生长状态良好时，加入0、10、25、50、100、200 μmol/L的BSO培养48 h。PBS漂洗细胞1次，离心后移去上清，收集细胞。加入细胞沉淀体积3倍量的偏磷酸缓冲液充分混悬，利用液氮和37 ℃水浴对样品进行两次快速的冻融，以4 ℃、10 000 g离心10 min，吸取上清。用DTNB法检测GSH。测定氧化型谷胱甘肽(GSSG)时，样品中GSH用2-vinylpyridine在37 ℃水浴1 h消除，反应体系由磷酸缓冲液(pH值为7.0)、EDTA、NADPH、谷胱甘肽还原酶、DTNB和样品组成。25 ℃反应30 min后在412 nm处测定吸光值，代入标准曲线获得GSSG水平，同时用考马氏亮蓝法测定样品中的谷胱甘肽水平，结果以mg/g蛋白表示。根据以下公式计算GSH水平：GSH=谷胱甘肽蛋白水平-2×GSSG。

1.4 BSO对L-02细胞p38磷酸化水平影响的观察 采用Western blotting法。将L-02细胞铺入6孔板，密度2×105个/孔，12 h后换含0.1%牛血清白蛋白无血清的RPMI 1640培养基，2 h后加入200 μmol/L的BSO。37 ℃环境下培养，0、2、12、24、36、48 h时吸净培养液，立即加入样品缓冲液(含有62.5 mmol/L Tris-HCl、2% SDS、10%甘油、50 mmol/L二硫代苏糖醇、0.1%溴酚蓝，pH 6.8)冰上超声裂解15 s，100 ℃水浴5 min变性。蛋白经10% SDS-PAGE胶电泳，湿法转膜至硝酸纤维素膜上。采用含5%脱脂奶粉和0.1% Tween-20的TBST溶液封闭后，加入p38、p-p38一抗孵育过夜，再以辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h。用增强型化学发光检测系统检测过氧化物酶活性，以此表示p38、p-p38水平。p38磷酸化水平=p-p38/p38。

1.5 BSO对L-02细胞活性氧簇(ROS)水平影响的观察 采用荧光探针H2DCFDA法。将L-02细胞铺入6孔板，密度2×105个/孔，12 h后待细胞贴壁生长状态良好时，加入ROS荧光探针H2DCFDA(200 μmol/L)，加入BSO(200 μmol/L)继续培养0、2、6、12、24、48 h。收集细胞沉淀，加入250 μL细胞裂解液，冰浴 5 min，液氮速冻，37 ℃水浴2 min，反复4次，冰浴10 min。4 ℃、10 000 g离心10 min，取上清测荧光值，发射光波长(525±20)nm，同时测样品蛋白浓度。结果用蛋白浓度校正。

1.6 SB203580联合BSO对L-02细胞存活率和ROS水平影响的观察 设对照组、BSO组、SB203580组和BSO+SB203580组。对照组不加任何药物；BSO组只加入终浓度为200 μmol/L的BSO；SB203580组只加入终浓度为20 μmol/L的SB203580；BSO+SB203580组先加入终浓度为20 μmol/L的SB203580孵育15 min后加入终浓度为200 μmol/L的BSO。24 h后采用MTT法测算各组细胞存活率，具体方法同1.3；采用荧光探针H2DCFDA法检测ROS水平，具体方法同1.5。

2 结果

2.1 不同浓度BSO干预后L-02细胞48 h细胞存活率比较 0、10、25、50、100和200 μmol/L的BSO培养L-02细胞48 h后细胞存活率分别为100.00%±0.00%、102.07%±8.28%、97.56%±3.86%、93.46%±3.02%、89.48%±10.35%、84.91%±5.04%。从50 μmol/L开始，BSO可以剂量相关性地降低L-02细胞的存活率(P均<0.05)。

2.2 不同浓度BSO干预后L-02细胞GSH含量比较 0、10、25、50、100、200 μmol/L的BSO培养L-02细胞48 h，L-02细胞GSH水平分别为(23.16±12.14)、(8.39±0.66)、(2.79±2.64)、(2.63±2.06)、(2.60±2.17)、(2.22±1.83)mg/g蛋白。BSO可以剂量相关性地降低L-02细胞GSH含量，BSO浓度为25 μmol/L时达到最低值。

2.3 BSO干预不同时间L-02细胞p38磷酸化水平比较 200 μmol/L的BSO培养L-02细胞0、2、12、24、36、48 h时L-02细胞p38磷酸化水平分别为1.00±0.00、1.23±0.167、1.46±0.35、1.84±0.59、2.15±1.07、1.85±0.39。BSO呈时间依赖性增加L-02细胞内p38磷酸化水平(P均<0.05)。

2.4 BSO干预不同时间L-02细胞ROS水平比较 200 μmol/L的BSO培养L-02细胞0、2、6、12、24、48 h，L-02细胞ROS水平分别为1.00±0.00、1.04±0.27、1.11±0.25、1.20±0.15、1.68±0.27、1.52±0.17。 加入BSO后L-02细胞ROS水平均较对照组提高(P均<0.05)，培养24 h时达到高峰。

2.5 SB203580联合BSO干预后各组细胞存活率和ROS水平比较 对照组、BSO组、SB203580组和BSO+SB203580组细胞存活率分别为100.00%±0.00%、83.78%±2.42%、90.38%±2.60%、94.55%±12.45%，对照组、BSO组、SB203580组、BSO+SB203580组ROS水平分别为1.00±0.00、5.80±0.59、1.02±0.01、3.75±0.78。BSO组L-02细胞ROS水平高于对照组(P<0.05)，细胞存活率低于对照组(P<0.05)；SB203580组L-02细胞ROS水平和细胞存活率与对照组相比P均>0.05；BSO+SB203580组L-02细胞ROS水平低于BSO组(P<0.05)，细胞存活率高于BSO组(P<0.05)。

3 讨论

BSO是细胞内谷胱甘肽合成酶的强效抑制剂，能减少谷胱甘肽的生物合成，降低细胞内GSH水平，进而提高放射线以及化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果[2～6]，作为肿瘤治疗增敏剂具有很高的应用价值。GSH是细胞自我保护系统的重要物质之一，也是DNA合成中不可缺少的小分子巯基化合物，具有清除氧自由基、维持细胞内正常氧化还原环境和蛋白质结构与功能稳定等多方面的作用。BSO进入体内可同时作用于肿瘤细胞和正常细胞，但其对正常细胞的毒性鲜有报道。大部分药物的毒性主要表现为肝毒性，因此在肝细胞水平上评价药物的安全性逐渐成为研究药物毒性的重要途径。本研究结果表明BSO剂量为25 μmol/L和50 μmol/L时，具有微弱的肝细胞毒性；剂量达100 μmol/L和200 μmol/L时，具有明显的肝细胞毒性。10 μmol/L的BSO就可明显降低细胞内GSH含量，其降低程度随BSO剂量的增加而不断增强。研究发现BSO对正常肝细胞具有一定的细胞毒性，仍需利用体内实验进一步研究其对肝脏的毒性机理。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是哺乳动物中表达的主要信号蛋白，主要包括胞外信号调节激酶(ERK1/2)、p38激酶、c-Jun氨基端激酶(JNK1/2)，其在调控细胞生长、分化、凋亡等病理生理过程中发挥重要作用[7]。研究发现，p38信号通路的激活以及其下游鞘氨醇激酶-1(SphK1) 的表达上调在急性肝衰竭中扮演了重要的角色[8]；对苯二胺可通过激活p38、JNK信号通路，同时产生ROS进而诱导后续肝细胞的凋亡[9]；肝脏枯否细胞内p38信号通路的激活在烧伤导致的肝脏损伤以及肺部炎性中具有重要的参与作用[10]。以上研究均表明p38信号通路在肝脏损伤中扮演了重要角色。本研究结果表明BSO可诱导p38激酶的磷酸化激活，其抑制剂SB203580可逆转BSO的肝细胞毒性，拮抗BSO降低细胞活性的作用。上述结果说明p38激酶信号通路可能参与调控了BSO诱导的肝细胞毒性。

本研究证实了肿瘤治疗增敏剂BSO的肝细胞毒性，并初步探讨了其可能的毒性发生机制；为BSO的临床安全应用提供了重要信息。但本研究内容为体外实验，BSO的体内毒性作用及其机制有待进一步研究。

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