不同剂量山奈酚对胰腺癌细胞株PANC-1增殖、凋亡的影响及机制探讨

陈卓，刘胜楠，吴克俭，陈光侠，何晓华

(1徐州市第一人民医院，江苏徐州221000；2徐州医科大学附属医院)

山奈酚是一种黄酮类化合物，主要来源于山奈、藏红花等药用植物，此外还广泛存在于西兰花、葡萄、绿茶等多种植物中。既往研究证实，山奈酚可以在肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中表现出诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤组织侵袭及转移的作用[1, 2]，但至今为止，国内外尚未见山奈酚对胰腺癌细胞影响的报道。胰腺癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，由于缺乏特异性的临床症状和早期诊断方法，往往患者在就诊时已经处于肿瘤晚期，但是由于胰腺癌细胞获得性或内在的耐药性，传统化疗药物的效果也不甚理想[3]，因此继续探索有效的抗胰腺癌药物具有重要临床意义。另有研究发现Toll样受体4(TLR-4)/NF-κB信号通路参与了包括胰腺癌在内的多种肿瘤的进展[4]。本研究观察了山奈酚培养的人胰腺癌PANC-1细胞增殖、凋亡、周期分布及其TLR-4/NF-κB信号通路相关蛋白表达情况，探讨山奈酚作为胰腺癌化疗药物的可能性及其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 人胰腺癌PANC-1细胞株购自中国科学院上海细胞资源中心。山奈酚为购自东京化成工业株式会社(纯度>97%)。DEME高糖培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素购自美国Gibco公司。胎牛血清(FBS)、二甲亚砜(DMSO)、NF-κB p65抗体购自美国Sigma公司。激活型Caspase-3抗体、TLR-4抗体、VEGF抗体购自美国Santa Cruz公司。CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。

1.2 细胞培养、分组及山奈酚应用方法 将人胰腺癌PANC-1细胞用含有10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DEME-高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。待PANC-1细胞贴壁生长后，取对数生长期的细胞用于实验。设对照组和观察1、2、3、4组，观察1、2、3、4组分别用20、40、80、160 μmol/L的山奈酚，对照组加等量生理盐水。

1.3 各组细胞增殖情况观察 采用CCK-8法。将对数生长期的PANC-1细胞接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，PANC-1细胞密度3×104/mL。待细胞贴壁生长后，弃上清，每孔加入100 μL不同浓度(0、20、40、80、160 μmol/L，即对照组、观察1组、观察2组、观察3组、观察4组)的山奈酚培养24、48、72，每组设5个复孔。处理完毕后，每孔均避光更换为100 μL培养液加10 μL CCK-8溶液，继续避光培养2 h后，使用酶标仪测定在450 nm处每孔的吸光光度值(OD)，根据OD值计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-观察组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 各组细胞周期检测 采用流式细胞术。向6孔板中每孔加入2 mL密度为2×105/mL的PANC-1细胞悬液，待细胞贴壁生长后，更换含不同浓度(0、20、40、80、160 μmol/L，即对照组、观察1组、观察2组、观察3组、观察4组)的山奈酚溶液处理48 h，每组设3个复孔，重复3板。终止培养后，收集细胞，离心(2 000 r/min，5 min)沉淀细胞，弃上清，用PBS洗涤细胞2次后，制备密度为1×106/mL的细胞悬液，取1 mL细胞悬液离心，弃上清后，用0.5 mL PBS重悬细胞，并迅速打入3.5 mL预冷的乙醇中，吹打均匀，4℃过夜。取乙醇固定过的细胞离心，弃上清，用PBS洗涤细胞2次后，加入100 μL RNase A，37℃水浴30 min，随后加入400 μL碘化丙啶(PI)染色混匀，4℃避光保存30 min后，用流式细胞仪测算各期细胞百分比。

1.5 各组细胞凋亡率测算 用流式细胞术制备细胞密度为2×105/mL的PANC-1细胞悬液，每孔2 mL接种于6孔板中，每组设3个复孔，重复3板，待细胞贴壁生长后，更换含不同浓度(0、20、40、80、160 μmol/L，即对照组、观察1组、观察2组、观察3组、观察4组)山奈酚的培养液处理48 h。终止培养后，收集细胞，离心(2 000 r/min，5 min)沉淀细胞，弃上清，用PBS洗涤细胞2次后，用500 μL Binding Buffer悬浮细胞，随后加入5 μL Annexin V-FITC混匀，置于冰上，室温、避光保存10 min，然后加入5 μL PI混匀，置于冰上，室温、避光保存5 min，用流式细胞仪测算细胞凋亡率。

1.6 各组细胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白检测 采用Western blotting法。对照组和观察1、2、3、4组分别用0、20、40、80、160 μmol/L的山奈酚处理PANC-1细胞48 h，然后用4℃预冷的PBS冲洗细胞3次，加入蛋白裂解液，摇匀后于冰上裂解30 min，结束后用细胞刮刀收集细胞，于4 ℃离心(12 000 r/min，10 min)，取上清液，应用BCA法测定蛋白浓度。在经过蛋白提取及浓度检测后，每泳道上样50 μg蛋白，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，封闭。结束后膜上加入TLR-4、NF-κB、VEGF、Caspase-3一抗4 ℃继续培养过夜，TBST洗膜3次，再加入二抗室温孵育2h，TBST洗膜3次，加入电化学发光法发光液，在暗室中显影X线片，图像扫描。以 β-actin 为内参照。目的蛋白相对表达量以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值之比表示，以对照组表达量为100%，计算观察1～4组各蛋白表达量相对值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 培养24、48、72 h各观察组细胞增殖抑制率见表1。作用相同时间的情况下，随着山奈酚药物浓度的递增，PANC-1细胞增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)；在山奈酚浓度相同的情况下，随着作用时间增加，PANC-1细胞增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)山奈酚以时间-剂量依赖的方式对PANC-1细胞表现出显著的增殖抑制作用。

表1 培养24、48、72 h各观察组细胞增殖抑制率比较

注：与对照组相比，aP<0.05；与观察1组相比，bP<0.05；与观察2组相比，cP<0.05；与观察3组相比，dP<0.05；

2.2 各组细胞周期比较 各组细胞周期分布见表2。随着山奈酚浓度的递增，S期PANC-1细胞的比例逐渐上升(P均<0.05)，G0/G1期PANC-1细胞的比例逐渐下降(P均<0.05)。山奈酚以剂量依赖的方式将PANC-1细胞增殖阻滞在S期。

表2 各组细胞周期分布比较

注：与对照组相比，aP<0.05；与观察1组相比，bP<0.05；与观察2组相比，cP<0.05；与观察3组相比，dP<0.05；

2.3 各组细胞凋亡率比较 对照组、观察1组、观察2组、观察3组、观察4组细胞凋亡率分别为6.5%±1.5%、8.5%±1.7%、17.4%±2.1%、38.3%±2.9%、73.1%±2.7%。随着山奈酚浓度的增加，PANC-1细胞凋亡率逐渐升高(P均<0.05)，随着山奈酚浓度的增加，PANC-1细胞凋亡率逐渐升高(P均<0.05)，山奈酚以剂量依赖的方式诱导了PANC-1细胞的凋亡。

2.4 各组细胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白相对表达量比较 各观察组细胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白相对表达量见表3。随着山奈酚浓度的增加，PANC-1细胞中TLR-4、NF-κB、VEGF蛋白相对表达量逐渐下降(P均<0.05)，Caspase-3蛋白相对表达量逐渐上升(P均<0.05)。山奈酚以剂量依赖的方式抑制了TLR-4/NF-κB信号通路蛋白TLR-4、NF-κB的表达，并且下调了VEGF的表达，上调了Caspase-3的表达。

表3 各观察组细胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白相对表达量比较

注：与对照组相比，aP<0.05；与观察1组相比，bP<0.05；与观察2组相比，cP<0.05；与观察3组相比，dP<0.05；

3 讨论

山奈酚作为在多种食材和传统中药中提取的有效作用成分，已经被证实在包括肝癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中产生有效的抗肿瘤作用[5～7]。如Halimah等[8]报道，山奈酚可以在乳腺癌中通过释放细胞色素C等凋亡因子，最终通过激活Caspase级联反应在肿瘤细胞中产生诱导凋亡作用。也有研究显示，山奈酚可以通过调节环氧合酶-2等炎性介质，进而下调VEGF、低氧诱导因子(HIF-1)等mRNA转录，降低VEGF蛋白表达，最终抑制肿瘤侵袭[9]。本研究结果显示，山奈酚不仅可以以时间-剂量依赖的方式抑制PANC-1细胞的增殖，而且剂量依赖性诱导PANC-1细胞凋亡。此外，山奈酚还可以将PANC-1细胞阻滞于S期，其通过影响肿瘤细胞周期也是其抗肿瘤作用的机制之一。

TLR-4作为Toll样受体家族中第一个被识别的受体，和家族成员一样，在生物体先天性免疫反应和后天炎症反应之间起重要的纽带作用。越来越多的证据表明，TLR-4通过介导肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭等方式，深度参与了包括胰腺癌在内的多种肿瘤的发生和发展。如Yu等[10]在用黑灵芝多糖处理S-180肉瘤的体外实验中发现，TLR-4蛋白表达量的降低与Caspase-3之间存在负相关性。事实上有研究发现，TLR-4及其下游重要中转因子NF-κB在胰腺癌癌灶和癌周呈现过度表达的现象，并且实验数据显示，肿瘤组织中TLR-4表达缺失患者的生存期显著高于肿瘤中TLR-4过表达的患者的生存期[11]。本研究结果显示山奈酚以剂量依赖的方式下调TLR-4、NF-κB和VEGF蛋白表达，上调Caspase-3蛋白的表达。Caspase-3在Caspase凋亡信号转导网络中起执行者的作用[12]。VEGF通过刺激血管生成因子，促进肿瘤组织中新生血管的形成，与恶性肿瘤的侵袭和转移之间密切相关[13]。这说明山奈酚可以剂量依赖性的诱导胰腺癌细胞凋亡并抑制其侵袭，有可能是新的抗胰腺癌药物。

综上所述，山奈酚可以抑制胰腺癌细胞增殖，促进其凋亡，阻滞细胞周期于S期，其机制可能与TLR-4/NF-κB信号通路及其下游蛋白VEGF、Caspase-3有关。

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