妊娠期PM2.5暴露诱导子代鼠大脑皮层中p53、c-Fos表达升高

郑昕蕊，刘婉婷，王婷婷，孙丽娟，吕莹，杨瑞，于丽

（潍坊医学院临床医学院组织学与胚胎学教研室，山东省神经疾病与再生修复重点实验室，潍坊261053 ）

快速城市化和工业化导致能源消耗和污染物排放量急剧增加。空气污染物中的主要有害成分是颗粒物（particulate matter, PM），尤其是细颗粒物（空气动力学直径＜2.5 µm，PM2.5），其主要化学组分包括无机硝酸、硫酸盐、有机化合物、元素碳及粉尘等五类物质，与严重空气污染引发的健康威胁密切相关，PM2.5对人体的危害远远大于粗颗粒[1-3]。由于胚胎期对外界环境刺激较出生后更为敏感，相较于出生后PM2.5暴露，妊娠期PM2.5暴露对子代生长发育的影响更为明显[4-5]。课题组前期实验表明妊娠期暴露在PM2.5环境中可导致子代鼠出现脑损伤，并引起细胞凋亡[6]。凋亡相关基因p53和c-Fos是否参与此过程，机制尚不明确。因此本实验选用妊娠期PM2.5暴露的子代鼠作研究对象，通过对大脑皮层部位凋亡相关基因p53和c-Fos表达的检测，进一步探讨妊娠期PM2.5暴露导致子代大脑皮层损伤的分子机制，从而为评价妊娠期空气污染物暴露引起胎儿神经发育异常的风险提供实验依据。

材料和方法

1 PM2.5悬浊液的制备

利用大气颗粒物采样器采取某地级市城区2016年12月至2017年3月间暖季的大气细颗粒物PM2.5。PM2.5样品的制备方法参考课题组前期的研究[6]

2 动物分组和造模

SPF级昆明小鼠，8～9周龄，体重32～38g,按 2∶1雌雄比合笼，次日查出阴栓者记为妊娠第1d。将孕鼠随机分为空白组、 PBS 对照组、 PM2.5低、中、高剂量组，每组6只。参照课题组前期方法[7]，从妊娠期第1d开始，每3d在PM2.5模型组使用气管滴注改良法滴注 PM2.5悬浊液 30 µl（低剂量组 0.2592µg/µl、中剂量组1.56695µg/µl、高剂量组3.456µg/µl），PBS对照组滴注相同剂量PBS缓冲液，空白组不做任何处理，整个孕期共7次。本实验过程合理使用实验动物，并经过动物伦理委员会批准。

3 荧光定量PCR技术检测p53和c-Fos mRNA表达

采用Trizol试剂提取出生后14d子代鼠大脑皮层组织总RNA。测RNA浓度，根据RNA浓度进行定量。用PCR仪按说明书进行cDNA反转录。以cDNA为模板， PCR分别扩增β-actin、p53、c-Fos，反应体系为10×PCR Buffer，dNTP，RNase和反转录酶。采用SYBR染料法反应体系，即SYBR和上、下游引物，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。各引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of the primers for RT-qPCR

4 Western blot检测p53和c-Fos表达

分离出生后14d子代鼠大脑皮层组织，将组织匀浆后4℃ 12000 r/min离心15min，留上清，测蛋白浓度。将20µg蛋白组织进行电泳、转膜，PVDF膜置于5%脱脂奶粉封闭2小时后根据需要裁膜，分别放入抗体工作液稀释的鼠抗p53（1∶ 200，美国Cell Signaling Technology 公司）和兔抗 c-Fos（1∶ 300，美国Cell Signaling Technology 公司）中4℃冰箱孵育过夜，再分别用TBST稀释的羊抗鼠IgG（1∶ 2000，美国Proteintech公司）和羊抗兔IgG（1∶ 1000，美国 Proteintech公司）孵育1h，在暗室进行曝光显影定影。

5 免疫荧光染色检测p53和c-Fos的表达分布

子代鼠出生后第14d，5%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.9% NaCl和4%多聚甲醛全身灌注，完整剖取鼠脑；将鼠脑依次放入4℃ 30%、25%、20%蔗糖梯度脱水；冰冻切片，切片厚度15µm，-20 ℃保存；复温后进行抗原修复，待室温冷却后10%羊血清封闭1 h，再分别加入鼠抗p53（1∶ 200，美国Cell Signaling Technology 公司）、兔抗 c-Fos（1∶ 50，美国Cell Signaling Technology 公司），37℃烤箱孵育0.5h后放于4℃冰箱过夜，避光加入FITC标记的羊抗小鼠IgG（1∶200，美国Millipore 公司）或TRITC标记的羊抗兔IgG（1∶ 200，美国Millipore 公司），37℃烤箱孵育50min后用Hoechst（1∶ 1000）染色于37℃烤箱孵育20min，抗荧光衰减封片剂进行封片，荧光显微镜观察并拍照，Image-Pro Plus软件分析，每组取5张切片，每张切片取5个视野进行荧光强度分析。

6 统计学分析

利用SPSS22.0软件对实验数据进行分析，数据用均数±标准差表示。多组间的比较用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较用 LSD-t 检验。检验水准 α = 0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 妊娠期PM2.5暴露导致子代鼠大脑皮层c-Fos表达增多

Western blot分析显示，与对照组相比，PM2.5低剂量组子代鼠大脑皮层c-Fos蛋白表达略增多，但无统计学意义，PM2.5中、高剂量组c-Fos蛋白表达明显增多，差异有统计学意义（图1A、B）。荧光定量RT-PCR检测显示，与对照组相比，PM2.5中、高剂量组子代鼠大脑皮层c-Fos mRNA表达明显增多（图1C）。子代鼠大脑皮层额叶区免疫荧光染色和免疫荧光强度定量分析显示，c-Fos在正常细胞中在细胞核和细胞质同时表达，而在PM2.5模型组几乎在细胞质表达，c-Fos阳性细胞主要分布在额叶区皮层的锥体细胞层、内颗粒层和节细胞层（Ⅲ-V层）；c-Fos免疫反应性随PM2.5浓度增加而增强，对照组与空白组相比，c-Fos免疫反应性无差别，与对照组相比，PM2.5低、中、高剂量组c-Fos免疫反应性增强，差异有统计学意义（图2A、B）。c-Fos表达与PM2.5浓度呈剂量依赖关系，而正常皮层组织中c-Fos表达较低。

图1 高剂量PM2.5暴露后子代鼠大脑皮层c-Fos表达增强。 A，c-Fos表达水平的Western blot检测；B ，蛋白相对水平的统计学分析；C，c-Fos mRNA水平的RT-PCR检测；Con，Control，Mo，mock-treated；L，low group；M，medium dose；H，high dose；与对照组相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.1 Detection for the expression level of c-Fos in the cerebral cortex of offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy. A,western blot detection for the expression of c-Fos protein; B, statistical analysis for relative protein expression levels; C, RT-PCR detection for c-Fos mRNA; Con, Control; Mo, mock-treated; L, low group; M, medium dose; H, high dose; compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜P＜0.05; **,P＜0.01; n=5

2 妊娠期PM2.5暴露导致子代鼠大脑皮层p53表达增加

Western blot检测显示，与对照组相比，p53蛋白表达逐渐增多，并与PM2.5剂量成正比，且PM2.5中、高差异有统计学意义（图3A、B）。荧光定量RT-PCR分析表明，与对照组相比，PM2.5中剂量组子代鼠大脑皮层p53 mRNA表达增多，差异具有统计学意义，PM2.5高剂量组p53 mRNA表达显著增多（图3C）。子代鼠大脑皮层额叶区免疫荧光染色和免疫荧光强度定量分析发现，p53阳性细胞主要分布在额叶区皮层的外颗粒层、锥体细胞层、内颗粒层和节细胞层（Ⅱ-V层），其中PM2.5低、中剂量组p53在细胞质中表达明显，而p53在PM2.5高剂量组的细胞核、细胞质中均有表达；p53免疫反应性随PM2.5浓度增加而增强，与对照组相比，PM2.5低、中、高剂量组p53免疫反应性明显增强，差异显著（图4A、B）。

讨 论

大气颗粒物尤其是平均空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物（PM2.5）构成了引起空气污染的主要原因。重金属，聚芳族烃和其他有毒类物质易吸附到PM2.5表面，并且可随PM2.5达到人体的一些特殊部位，导致功能的紊乱[7]。研究表明，空气污染对孕妇和胎儿的发育有不利影响[8-9]。PM2.5颗粒物直径很小，入肺后能透过母体气血屏障和胎盘屏障，因此妊娠期暴露于空气污染环境中，将对胎儿发育造成潜在的危害。在怀孕期间，胎儿神经系统可能更容易受到环境毒物的负面影响，大脑的结构和功能改变可能与神经发育的结局有关，例如导致后代认知-运动发育水平降低和行为问题风险增加，还包括发育迟缓等负面影响[10-11]。

图2 高剂量PM2.5暴露后免疫荧光检测显示子代鼠大脑皮层额叶区c-Fos表达增强。A，c-Fos免疫荧光染色， Hoechst 复染细胞核；比例尺，20µm；B，c-Fos免疫荧光强度统计学分析；与对照组相比：*， 0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.2 Detection for c-Fos by immuno fluorescence in the frontal cortex of the offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy.A, immuno fluorescence staining of c-Fos , Hoechst counterstaining of nuclei; scale bar, 20µm; B, statistical analysis of c-Fos immuno fluorescence intensity; compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜ P＜0.05; **, P＜0.01; n=5

图3 高剂量PM2.5暴露后子代鼠大脑皮层p53表达增强。 A，p53蛋白水平的Western blot检测；B，蛋白相对水平的统计学分析；C，p53的mRNA水平RT-PCR检测；Con，Control；Mo，mock-treated；L，low group；M，medium dose；H，high dose；与对照组比较：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.3 Detection for the expression of p53 in the cerebral cortex of the offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy. A, detection for p53 protein by western blot; B, statistical analysis for relative protein expression levels; C, detection for p53 mRNA levels by RT-PCR ; Con,Control; Mo, mock-treated; L, low group; M, medium dose; H, high dose; compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜ P＜0.05; **, P＜0.01; n=5

妊娠是一个相当复杂的生理过程，环境刺激对母体功能的潜在影响与胎儿发育有直接关系[12]。课题组前期已观察到妊娠期PM2.5暴露可导致子代鼠脑损伤，并通过Caspase-3检测初步推测妊娠期PM2.5暴露可引起子代鼠脑组织神经细胞发生凋亡。p53和c-Fos是应激反应、氧化应激、炎症和细胞凋亡有关的分子标志物[13]。本实验发现，妊娠期PM2.5暴露诱导子代鼠脑组织中p53、c-Fos基因转录和翻译水平均增加。p53是细胞正常功能所必需的重要调节因子，参与细胞存活和死亡相关的许多过程。近年来，大量的证据表明，p53可从细胞质转移到线粒体并激活线粒体相关的凋亡途径。p53升高可以引发细胞凋亡，从而消除DNA已被破坏无法修复的细胞，以防止其恶性转化。尽管DNA损伤可能是导致p53积聚的主要信号，但在去核细胞中可能会发生一些早期的信号传导，快速激活的膜相关蛋白激酶和信号分子参与了这些早期步骤，并激活AP-1和NF-κB。原癌基因c-Fos是一种即刻早期基因，与多种有丝分裂素诱导的细胞增殖和分化密切相关[14]。此外，c-Fos蛋白与抗增殖条件诱导的凋亡细胞死亡有关。c-Fos核蛋白与Jun家族蛋白二聚化形成转录因子AP-1复合物，其参与不同的细胞过程，包括细胞增殖、分化和凋亡[15]。c-Fos作为p53靶基因，其活化可能有助于p53的下游作用，这种作用是通过c-Fos基因的第一个内含子内的独特元件介导的，该基因与p53特异性结合。本实验进一步用免疫荧光检测发现，c-Fos、p53蛋白在大脑皮层额叶区的锥体细胞层、内颗粒层和节细胞层（Ⅲ-V层）中表达增多，并且PM2.5模型组c-Fos几乎定位在细胞质。在细胞正常增长的情况下c-Fos可在细胞核和细胞质同时表达[16]，妊娠期PM2.5暴露可诱导子代鼠中枢神经系统中c-Fos的表达。细胞受刺激后，细胞核内的c-Fos基因被激活，转录形成mRNA，后者进入胞浆，翻译合成核磷蛋白，即c-Fos蛋白。当PM2.5炎性刺激使细胞凋亡程序启动，p53和c-Fos表达增多，证明了妊娠期PM2.5暴露对子代鼠大脑皮层的影响。

综上，我们推测妊娠期PM2.5暴露可导致子代鼠大脑皮层凋亡相关基因c-Fos、p53激活，这可能导致细胞发生凋亡，是PM2.5致子代大脑皮层损伤的分子机制之一。妊娠期PM2.5暴露对子代鼠的生长发育中大脑皮层会产生不良的影响，妊娠期PM2.5暴露对新生儿的影响应引起社会高度关注。

图4 PM2.5暴露后子代鼠大脑皮层额叶区免疫荧光检测显示p53表达增强。A，p53免疫荧光染色， Hoechst 复染细胞核；比例尺， 20µm；B，p53免疫荧光强度统计学分析；与对照组相比：*， 0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.4 Detection for p53 by immuno fluorescence in the frontal cortex of the offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy.A, immuno fluorescence staining of p53, Hoechst counterstaining of nuclei; scale bar, 20µm; B, statistical analysis of p53 immuno fluorescence intensity;compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜ P＜0.05; **, P＜0.01; n=5