胎儿颈项透明层厚度与染色体异常的相关性研究

马 莹,陈 奕

(首都医科大学附属北京妇产医院产科，北京 100026)

胎儿颈项透明层(nuchal translucency，NT)是早孕晚期胎儿颈后皮下液体积聚，超声征象表现为颈后无回声区。通过超声测量孕11～13+6周胎儿的NT厚度，预测胎儿染色体畸变及其他异常的风险，进一步通过介入性产前诊断，利用分子生物学或细胞遗传学方法分析胎儿染色体的情况，可降低出生缺陷。随着我国计划生育政策的改变，高龄产妇增多，如何积极有效地早期预测胎儿染色体异常，提高出生人口质量的同时降低介入性产前诊断带来的风险，有必要探讨NT增厚程度与胎儿染色体异常的关系。然而国内目前尚无统一的NT增厚标准，当NT 厚度超过第99 百分位数(即3.5mm)时断定NT增厚无争议，但对NT厚度超过第95 百分位数(即2.5mm)判断为NT增厚有争议。本研究通过分析457例NT≥2.5mm胎儿的染色体结果，探讨NT厚度与胎儿染色体异常的关系，NT临界厚度(2.5～2.9mm)的临床意义，以及低覆盖度大规模平行测序技术(low-coverage massively parallel CNV sequencing, CNV-seq)结合短串联重复序列(short tandem repeats, STR)检测对NT≥2.5mm胎儿产前诊断的应用价值。

1资料与方法

1.1 研究对象

选取首都医科大学附属北京妇产医院2013年1月至2016年12月孕11～13+6周彩色多普勒超声检查，提示根据国际标准和平面标准测量胎儿顶臀长(CRL)在45～84mm，NT≥2.5mm的在首都医科大学附属北京妇产医院就诊，并接受介入性产前诊断的孕妇，记录孕妇的姓名、NT厚度、超声提示合并结构情况、无创产前筛查(non-invasive prenatal testing，NIPT)结果，穿刺方法及染色体结果。所有研究对象均签署知情同意书，该项研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 介入性产前诊断

根据孕妇情况及其知情同意选择如下方法,①绒毛活检：孕11～14周经腹绒毛活检;②羊膜腔穿刺：孕18～24周行羊膜腔穿刺。

1.3 染色体的检测方法

①绒毛细胞或羊水细胞培养及染色体核型分析;②荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)；③CNV-seq结合STR检测。北京贝瑞和康生物技术有限公司进行检测。

1.4 NIPT的检测方法

经检测前知情同意后，于孕12～20周抽取孕妇外周静脉血5mL，置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，进行二次离心后提取血浆中的 DNA，制备测序文库并质控，应用高通量测序仪进行检测，将测序结果生成的数据与人类基因组序列进行比对，生物信息分析不同染色体水平的差异，计算出胎儿患21三体、18三体及13三体的风险值，风险值为(-3，+3)之间为低风险，超出范围为高风险。

1.5 统计学方法

按NT厚度为2.5～2.9mm、3.0～3.9mm、4.0～5.9mm及6.0mm以上分为四组，比较不同NT厚度各组胎儿染色体异常的情况。使用PASW Statistics 18.0软件，数据资料采用描述统计频率方法计算中位数，合并结构异常胎儿的NT厚度与不合并结构异常胎儿的NT厚度差异比较采用两独立样本的Mann-WhitneyU检验，合并结构异常与不合并结构异常胎儿染色体异常的差异采用χ2检验，NT厚度四组间差异采用多个样本率构成比的多重比较，进行列联表χ2检验，均以P<0.05为差异有统计学意义，如果进行两两比较则对检验水准进行校正，以P值低于校正后检验水准为差异有统计学意义。

2结果

2.1 一般情况

因NT≥2.5mm行介入性产前诊断的孕妇471例，去除资料不全及检测失败者18例，453例孕妇符合入组标准。4例双胎两胎儿均NT≥2.5mm，分别行染色体检查，共纳入研究457例胎儿。孕妇年龄19～42岁，中位数30岁，单胎439例，双胎14例，NT厚度2.5～13.5mm，中位数3.5mm。

2.2 其他筛查

入组病例术前行NIPT提示21三体高风险6例，18三体高风险3例，13三体高风险1例，47XXY 1例，行介入性产前诊断均证实无误，1例NIPT提示X染色体异常，证实为45X嵌合体，低风险2例，1例无误，1例虽然核型分析正常但是测序技术证实有致病性未知的微重复。

2.3 胎儿结构异常

NT≥2.5mm且超声提示合并结构异常者55例，包括颈部水囊瘤15例，心脏畸形8例，全身水肿或胸水、腹水21例，鼻骨缺失4例，脐膨出6例，骨骼畸形2例，全前脑1例，巨膀胱1例，单脐动脉5例，脉络丛囊肿2例，静脉导管A波反向1例，其他畸形4例。病例中超声提示结构异常者NT厚度2.5～13.5mm，中位数为5.6mm，无结构异常胎儿的NT厚度2.5～13.0mm，中位数为3.4mm，分析胎儿结构异常的NT厚度与无结构异常胎儿的NT厚度差异有显著性(P<0.001)。NT≥2.5mm且超声提示合并结构异常胎儿中染色体异常26例(47.3%)，合并结构异常与不合并结构异常比较，胎儿染色体异常的差异有显著性(χ2=23.012，P<0.001)。超声提示鼻骨缺失4例中3例为21三体，符合率达75%。

2.4 染色体结果

核型分析、FISH或两者联合检测233例，染色体异常43例(18.5%)。包括13三体1例，18三体10例，21三体25例(包括易位型1例)，45X2例，48XXYY及47XXY各1例，嵌合体3例，分别为45X(88)/46XX(12)，47XYY(17)/46XY(83)，XY(150)/XX(50)。

CNV-seq结合STR检测 224例，同时行核型分析75例，同时FISH检测1例，发现染色体异常及拷贝数变异( copy number variations, CNVs) 99例(44.2%)，除外未知性及多态性CNVs，457例胎儿中染色体异常检出率为22.1%(101/457)。染色体数目异常49例，包括13三体2例，15三体1例，18三体7例，45X 9例，21三体25例，47XXX 1例，嵌合体4例，分别为45X(80%)/46XX(20%)，47XN,+13(60%)/ 46XN(40%)，47XN,+18(80%)/46XN(20%)，45X(60%)/46XX(40%)，最后1例同时羊水核型分析45X(76)/46XX(24)。CNVs共有50例，包括多态性15例，未知性26例，致病性9例(4.0%)，致病性9例中5例由于缺失/重复>5Mb能通过常规核型分析检测出来，余4例致病性CNVs片段<5Mb常规方法不能检测出来，核型分析出遗传自母亲的染色体结构重排3例，CNV-seq结合STR检测未能提示结构重排，其中1例两者结合检测出染色体结构重排伴有致病性未知的CNVs。

2.5 NT厚度与胎儿染色体异常的关系

按NT厚度2.5～2.9mm、 3.0～3.9mm、4.0～5.9mm及6.0mm以上分四组，每组例数及胎儿染色体异常例数分别为87例，3例(3.5%);190例，35例(18.9%)；111例，32例(28.8%)；69例，31例(44.9%)，统计当NT≥3.0mm总的染色体异常率26.5%。随NT厚度增加胎儿染色体异常率显著增加，分析四组间差异有显著性(χ2=42.878，P<0.001)，两两比较并校正检验水准后第一组和其他各组比较差异均有显著性(P<0.01)，第二组和第四组比较差异有显著性(P<0.001)，而第二组和第三组、第三组和第四组比较差异无统计学意义，见表1。NT临界厚度(2.5～2.9mm)胎儿染色体异常者3例，1例超声提示鼻骨缺失，2例穿刺术前行NIPT高风险。

表1 NT厚度组间多个样本率构成比的比较[n(%)]
Table 1 Comparison of the constituent ratio of multiple sample rates among groups with different NT thicknesses[n(%)]

NT分组总例数(n)胎儿染色体异常比较分析χ2P①2.5～2.9mm873(3.5)与②比较11.303<0.001与③比较21.5900.001②3.0～3.9mm19035(18.9)与③比较4.3860.036与④比较18.729<0.001③4.0～5.9mm11132(28.8)与④比较4.8470.028④6.0mm以上6931(44.9)与①比较38.843<0.001

注：校正检验水准后P<0.0083为差异有统计学意义。

3讨论

3.1 NT截断值与NT临界厚度

已知NT增厚是预测胎儿染色体异常和多种胎儿畸形的有效超声软标记。国内研究报道NT≥2.5mm的发生率占全部胎儿的1.58%[1]， NT厚度为2.5～3.0mm的病例占1.81%， NT≥3.0mm占0.78%[2]。本文统计457例NT≥2.5mm胎儿中染色体异常检出率为22.1%(101/457)，NT厚度为2.5～2.9mm胎儿的染色体异常率为3.5%，和其他各组比较差异均有显著性，当NT≥3.0mm染色体异常率为26.5%。前期邓洪梅等[1]统计我院2012年NT≥2.5mm者为173例，12例染色体异常，NT厚度为2.5～3.0mm的胎儿染色体异常率仅1%(1/100)，而NT≥3.5mm的染色体异常率达16.9%，初步研究出胎儿NT≤3.5mm，孕妇年龄<35岁，唐筛低风险，超声未提示结构异常，绝大多数为正常胎儿。一项来自以色列的多中心研究报道，将超声未提示结构异常的NT病例分为三组，NT≤2.9mm、NT3.0～3.4mm及NT≥3.5mm，以微阵列分析 (chromosomal microarray analysis，CMA) 技术评价后认为NT截断值定为3.0mm更为合理[3]。2016年ACOG发布了163号指南，指出孕11～14周NT≥3.0mm或大于相应胎儿头臀长的99%百分位数视为NT增厚，并且随着NT值增厚胎儿非整倍体异常风险增加，建议应给予遗传咨询，可提供无创DNA检测或绒毛活检，并且在孕中期应进行详细的超声筛查和胎儿心脏超声检查[4]，本研究数据也证实随NT厚度增加胎儿染色体异常率显著增加，与指南一致。但还统计了NT厚度为2.5～2.9mm胎儿的染色体异常率为3.5%(3/87)，3例染色体异常病例中1例超声提示鼻骨缺失，2例穿刺术前行NIPT高风险。

依据复习文献和研究结果本研究认为将NT截断值定为3.0mm，NT厚度为2.5～2.9mm定为临界厚度较为合理，当NT≥3.0mm或合并结构异常建议介入性产前诊断。近几年来随着NIPT的推广临床已经证实了其准确度较高，减少由于介入性产前诊断操作带来的手术风险，虽然目前NIPT检测染色体微小异常价值有限，但是其无创性和孕12周后即可进行体现其有良好的筛查价值，应重视在早孕期筛查中NT与NIPT的联合。国内报道NT厚度为2.5～3.0mm的病例占1.81%[2]，还应重视此部分NT值(即NT第95 百分位数至截断值)胎儿的后续咨询。本研究建议当NT为临界厚度即NT 2.5～2.9mm不合并胎儿结构异常时行NIPT，根据NIPT的结果及随后的中孕期超声筛查决定下一步处理，如果出现NIPT高风险或中孕期超声提示超声软指标再考虑行介入性产前诊断，可增加介入性产前诊断的检出率，患者接受度也较高，并同时降低染色体异常儿的漏诊。国内尚无统一的截断值标准，此建议需要更多研究。本研究中核型分析发现嵌合体3例，CNV-seq结合STR检测发现嵌合体4例，其中1例为45X[60%]/46XX[40%]，同时羊水培养核型分析45X[76]/46XX[24]，考虑两种方法报告嵌合比例不一致的原因可能是羊水培养的细胞发生了变异。

3.2 NT厚度与拷贝数变异

致病性NT厚度与CNVs在辨别胎儿染色体疾病方面具有重要作用，目前结合CMA和染色体核型分析是临床检测 CNVs的金标准，可提高染色体异常的检出率。Maya等[3]报道统计无结构异常的NT≤2.9mm、NT 3.0～3.4mm及NT≥3.5mm病例，对比NIPT及传统核型分析CMA技术检出染色体异常率明显增高，检出各组致病性CNVs率分别为1.7%、7.1%,和13.0%，有报道经荧光定量聚合酶链反应(QF-PCR)检测结果正常的122例NT≥3.5mm病例，行CMA检出致病性CNVs者7例(5.7%)，其中3例由于缺失/重复<10MB核型分析不能检测出来[5]，所以对NT增厚的胎儿使用CMA技术可使致病性染色体畸变检测率提高。本研究通过CNV-seq结合STR检测224例NT≥2.5mm的胎儿，检出致病性CNVs 9例(4.0%)，4例致病性CNVs缺失/重复<5MB常规染色体核型分析不能检测出来，与上述报道类似，提示对NT增厚的胎儿使用CNV-seq结合STR检测可使致病性染色体畸变检测率提高。

另外本研究核型分析出遗传自母亲的染色体结构重排3例，2例测序技术无法检测出，考虑为平衡性重排，两者结合检测出另1例胎儿染色体结构重排伴有致病性未知的CNVs，说明两者结合检测分析染色体结构重排情况更全面。有报道1例NT增厚的胎儿常规G显带分析染色体为45, XX, dic (9;13) (q34;p13)，而CMA分析出9q34.3缺失3.6Mb，并且缺失区域含有EhMT1基因，在NT增厚但是染色体核型提示结构异常的病例应用CMA检测更为细致[6]，与本研究一致。

3.3 NT厚度与胎儿结构异常

随着超声仪器分辨率的不断提高及超声工作者经验的不断积累，早孕期超声检查越来越普及和项目细化， 可发现很多胎儿结构异常，本研究统计颈部水囊瘤及胎儿水肿、胸腹水及心脏畸形是NT≥2.5mm胎儿超声图像中最常发现的结构异常，NT≥2.5mm合并有结构异常的胎儿染色体异常率达47.3%，合并结构异常胎儿的染色体异常率显著高于非合并结构异常者，鼻骨缺失对21三体的符合率达75%(3/4)，证实鼻骨缺失为预测21三体敏感性高的超声指标。王莉等[2]报道孕11～14周超声检查发现可疑胎儿异常28 例，NT≥3.0mm 合并结构异常11 例，19 例NT增厚胎儿中8例合并心脏畸形，提示当发现胎儿NT厚度异常时应仔细筛查结构。本文还发现胎儿有结构异常的NT厚度显著高于无结构异常胎儿的NT厚度，提示NT厚度增加时合并胎儿结构异常的可能性也增加。而2013年Sotiriadis等[7]对20多个NT相关研究进行Meta分析，染色体核型正常但患有心脏畸形的胎儿中，44%的胎儿NT厚度大于相应孕周的第95百分位数，20%的胎儿NT厚度大于相应孕周的第99百分位数，NT厚度对胎儿心脏畸形有预测意义。Yang等[8]对220例常规染色体核型分析正常的NT≥3.0mm胎儿进行比较基因组杂交(ACGH)检测并结合孕20～24周的筛畸超声检查，在有无结构异常胎儿中比较CNVs情况，发现9.1%(20/220)的胎儿存在CNVs，且超声提示结构异常的胎儿CNVs率显著高于无结构异常的胎儿(26.9% vs 6.7%)，提示NT增厚的胎儿虽然染色体核型正常，但当超声提示结构异常应考虑存在CNVs。因此当超声提示NT厚度增加和/或发现结构异常时对胎儿染色体异常及CNVs有预测价值，即使染色体核型正常，也建议增加胎儿超声心动图及孕期超声监测和考虑行CMA或CNV-seq检测是否存在CNVs。

除染色体异常外，淋巴系统发育迟缓、感染、贫血都可能与NT厚度相关。本研究认为NT截断值定为3.0mm，NT厚度为2.5～2.9mm定为临界厚度较为合理，不合并胎儿结构异常临界厚度的NT病例可以建议行NIPT，视其结果及随后的超声筛查决定下一步处理，可降低染色体异常儿的漏诊。NT厚度增加或发现胎儿结构异常时即使胎儿染色体核型无异常也建议增加胎儿超声心动图及孕期超声监测，对NT增厚和/或结构异常的胎儿使用CMA或CNV-seq可使致病性染色体畸变检测率提高。

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