应用蛋白质组学技术筛选抽动障碍患儿不同中医证型血清相关蛋白

王 端，贺 莉，张 婕，赵小艳，熊晓藩，贺文香，张海清，陈艳妮,

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.西安市儿童医院，陕西 西安 710000；3.西安交通大学，陕西 西安 710000)

抽动障碍(tic disorders,TD)是一种常于儿童时期起病，以不自主、反复、快速、无目的一个部位或多部位肌肉运动性抽动或发声性抽动为主要临床表现[1]，并可伴有注意力不集中、多动、强迫性动作或其他精神行为症状的慢性神经精神疾病[2]。本病可归属于中医学“慢惊风”、“瘛瘲”、“肝风”等范畴。关于抽动症状的描述最早可追溯到远古时代，但关于抽动障碍的病因及发病机制至今仍不清楚，治疗药物也因副作用明显而仅限于当抽动症状影响患儿或家长生活或学习时才予使用。目前认为TD具有明显的遗传倾向，但却无法以常染色体显性、隐性或性联遗传方式来解释[3]，故多认为TD是遗传因素与环境因素相互作用的结果。蛋白组学技术作为后基因时代的一种重要方法，可提供疾病病理过程中丰富的生物学信息，有助于进一步揭示TD的发病机制及探寻治疗靶点。本实验采用磁珠结合、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪联用技术(MALDI-TOF-MS)，对TD最常见证型气郁化火证、脾虚痰聚证患儿及正常儿童血清蛋白组进行比较，得出差异血清蛋白，从蛋白质水平揭示儿童TD的发病机制及不同中医证型间的微观物质表达。

1对象与方法

1.1研究对象

所有研究对象均来源于2017年4至9月西安市儿童医院儿保科门诊，包括TD患儿60例(气郁化火证34例、脾虚痰聚证26例)及同时期体检无特殊疾病的健康儿童30例，分别作为TD组和健康对照组。本研究经西安市儿童医院伦理委员会批准，所有入组儿童监护人均签署知情同意书。各组年龄、性别比较均无统计学差异，见表1。

组别例数(n) 性别 男女年龄(岁)健康对照组3026(86.67)4(13.33)7.36±2.11TD组6052(86.67)8(13.33)7.46±2.23 脾虚痰聚证21(80.77)5(19.23)7.71±2.45 气郁化火证31(91.18)3(8.82)7.26±2.06χ2/t1.1420.112P0.7030.947

1.2纳入与排除标准

纳入标准：TD组均符合美国《精神疾病诊断与统计手册》第5版TD诊断标准[4]及《中医儿科学》第9版TD气郁化火证或脾虚痰聚证的证型标准[5]；18岁以下儿童，不限男女；无其它神经精神类疾病；未服用过多巴胺受体阻滞剂、选择性单胺能阻滞剂、多巴胺自身受体激动剂、中枢性α受体激动剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等影响神经递质的药物。排除标准：同时患有其它神经精神类疾病的儿童；有服用多巴胺受体阻滞剂、选择性单胺能阻滞剂、多巴胺自身受体激动剂、中枢性α受体激动剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等影响神经递质的药物史的儿童；多种中医证型夹杂的患儿。

1.3材料及方法

1.3.1主要仪器及试剂

磁珠试剂盒：Profiling Kit 100 MB-WCX(货号8223983)、基质2-氰基-4羟基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid，HCCA)、磁珠分离器、AnchorChipTM质谱板、蛋白质芯片飞行时间质谱仪autoflex III smartbeam均购买自德国Bruker公司；采集软件：flexControl 3.3；标峰软件：flexAnalysis；统计软件：Clinpro Tools。

1.3.2标本采集及处理

采集肘静脉血3mL于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-k2)管中，摇匀，室温下静置2h，10℃、3 300r/min离心10min，取上层血清于EP管中，编号，保存于-20℃冰箱备检。

1.3.3蛋白质检测

样本处理：-20℃取出血清置于冰上融化。磁珠处理：①4℃冷藏储存室取出WCX磁珠悬浮液，完全混匀1min；②取7μL磁珠置于200μL样品管中，并加入10μL磁珠结合缓冲液(binding buffer，BB)，吹打20次混匀，再加入5μL样本，吹打10次混匀，室温静置5min；③将样品管放入磁珠分离器，使磁珠贴壁2min，液体澄清，弃上清液；④向样品管中加入100μL洗脱液(wash buffer,WB)，在磁珠分离器中来回移动10次，静置1min，弃上清液，共洗3次；⑤加入5μL洗脱液(elution buffer,EB)吹打20次混匀后使磁珠贴壁2min，转移上清液至新管；⑥加入5μL稳定液(stabilization buffer,SB)，混匀。点样：吸取1μL的处理样本至直径600μL的AnchorChipTM质谱板上，放置于室温下，待干燥后吸取1μL 0.3g/L浓度HCCA溶液至滴有处理样本的质谱板孔中，置于室温下干燥。上机：启动autoflex III smartbeam布鲁克质谱仪，放入质谱板，校正机器。应用flexControl 3.3采集软件，每个样本孔采集3次，以验证稳定性。应用flexAnalysis 3.3标峰软件及ClinproTools统计软件对蛋白波进行分析，选择差异峰标准P<0.05，差异倍数>1.9，受试者工作特征曲线下面积(AUC)>0.7。

1.4统计学方法

2结果

2.1TD组与健康对照组血清蛋白比较

本研究60例TD组患儿与30例健康对照组共检测蛋白峰64个，分析后发现，有5个不存在差异表达，有59个存在差异表达(P<0.05)，其中有8个蛋白峰存在显著表达差异(P<0.01)，其中最大差异蛋白峰相对分子质量(Mr)为6 642.05，差异倍数为3.24倍，最小差异蛋白峰Mr为2 293.11，差异倍数为1.98倍，见表2。

表 2 TD组与健康对照组差异蛋白峰

Table 2 Different protein peaks in TD group and healthy control group

2.2 TD气郁化火证与脾虚痰聚证血清蛋白比较

本组患儿中，TD气郁化火证与脾虚痰聚证血清蛋白比较，共检测蛋白峰65个，有58个存在差异表达(P<0.05)，其中有2个显著差异蛋白峰，见表3。

表3 气郁化火证与脾虚痰聚证差异蛋白峰

Table 3 Different protein peaks in cases of syndrome of qi depression transforming into fire and cases of spleen deficiency leading to phlegm syndrome

3讨论

3.1 TD与蛋白组学

TD是以抽动为主要临床表现的神经精神疾病，因其慢性、波动性、多发性的特点[1]使患儿家长倍受困扰，其中的Tourette综合征(TS)更因常共患其他神经精神疾病而使患者生活质量较健康儿童低[6]。目前对于该病的生化研究主要集中于对脑内神经递质的研究，病因及发病机制并不明确，临床诊断主要依靠描述性诊断并排除其他疾病，缺乏特异性诊断指标，临床用药也因副作用而表现出局限性[7]。蛋白组学技术的兴起及逐渐成熟提供了新的思路及方法，已在很多疾病领域有所突破，是临床医学中成熟的诊断工具，但在TD方面的研究还很少。本研究通过蛋白组学技术初步研究了TD患儿与健康儿童及气郁化火证与脾虚痰聚证TD患儿的血清蛋白质表达情况，比较出差异蛋白峰。将所得差异峰分子量输入uniprot数据库，共检索得到3个与神经精神疾病最相关的蛋白，分别为锌指蛋白神经源分化因子4、γ-氨基丁酸受体亚基α-2、神经源烟碱乙酰胆碱受体亚基α-5。

3.2 TD与健康儿童差异表达蛋白

3.2.1 TD与锌指蛋白神经源分化因子4

锌指蛋白神经源分化因子4(Zinc finger protein neuro-d4 )是由Buchman等于1992年克隆出的新基因neuro-d4编码的一种新型锌指蛋白。锌指蛋白广泛存在，在基因的表达调控中起重要作用，一些锌指蛋白在神经系统的发育中起作用[8]。Buchman等还发现与编码其它锌指蛋白的基因不同，neuro-d4特异性表达于神经系统，而且似乎仅限于某些特定的神经元中，原位杂交与印迹杂交结果均显示：在周围神经系统(背根神经节)以及在中枢神经系统的不同区域(在大脑皮层、海马、多个脑干核和小脑)中检测到neuro-d4 mRNA。虽然，既往关于TD的研究中，并没有发现与锌指蛋白神经源分化因子4有关的直接证据，但该蛋白与神经系统的密切关系使研究人员很难相信其与TD间没有联系。而且，Buchman等的研究还发现编码该蛋白的基因在成年鼠表达水平要低于胚胎末期及新生儿期，即生后逐渐下降，TD好发于儿童及青少年，较少见于成人，这也进一步验证了锌指蛋白神经源分化因子4与TD的关系。但因本研究中研究对象年龄较为集中，不能形成明显的年龄分层，故无法从该实验中进一步验证此说法。

3.2.2 TD与γ-氨基丁酸受体亚基α-2

γ-氨基丁酸受体亚基α-2(Gamma-amino￣butyric acid receptor subunit alpha-2)为γ-氨基丁酸受体的三级结构，γ-氨基丁酸(GABA)为脑内主要的抑制性神经递质，GABA能神经通路则为抑制性通路。研究表明TD儿童GABA能系统活动减弱，如Mondrup等于1985年研究发现，应用氟柳双胺(一种新型GABA受体激动剂)治疗TD患儿，患儿不自主运动有明显减少。但与该蛋白分子量6 455相近的6 443.34蛋白峰在TD组中表达升高，与该理论不符，故本研究中所得差异蛋白并非γ-氨基丁酸受体亚基α-2。

3.2.3 TD与神经源烟碱乙酰胆碱受体亚基α-5

神经源烟碱乙酰胆碱受体亚基α-5(neuronal nicotinic acetylcholine receptor, alpha5 subunit ，nAChRα-5，又称神经源烟碱受体亚基α-5)为组成烟碱乙酰胆碱受体的一个亚基，烟碱-胆碱能神经通路广泛存在于中枢神经系统，并对中枢神经系统起着非常重要的调节作用。研究表明烟碱受体与多种神经性疾病相关[9]。近年来得益于神经影像学的发展，大量研究已证实TD患儿中枢神经系统存在解剖及功能异常，如Miller等[10]于2010年报道，TD患儿存在海马、胼胝体、丘脑的发育异常；李秀丽等[11]于2010年通过弥散张量成像原理发现TD基底神经节功能活动异常，并且与抽动的严重程度相关。而McPhillips 等(1988年)报道nAChR的激活与大脑各功能区域的发育成熟密切相关，故我们推测nAChRα-5可能通过影响神经系统的成熟而导致TD。还有学者指出，nAChR可能对脑发育过程中谷氨酸(GLU)信号系统的发育成熟有重要影响[12]。GLU为哺乳动物中枢神经系统的主要内源性神经兴奋物质，GLU的主要受体之一使君子酸受体(AMPA)的数量决定突触后神经元的兴奋程度，是中枢神经系统中突触传递的主要影响因素。唐洪丽等于2002年通过高效液相色谱法测定TD患儿血浆GLU的水平发现明显高于正常对照组，且与TD所致的部分心理行为相关。故nAChRα-5也可能通过影响GLU信号系统而在TD的发生中发挥作用。TD与乙酰胆碱系统的关系尚未完全阐明，Quik等[13]报道指出，nAChR激动剂尼古丁减轻了抽动秽语障碍的运动障碍症状，但Sarah等(2010年)则认为TD是由多巴胺系统与胆碱能系统失衡所致，即胆碱能系统减弱。两种观点相反，若本研究所得差异蛋白峰后续经鉴定确为nAChRα-5，则对进一步研究TD与胆碱能系统的关系有一定的指导意义。

3.3 TD气郁化火证与脾虚痰聚证差异表达蛋白

气郁化火证与脾虚痰聚证TD患儿血清蛋白有2个差异蛋白峰，Mr为873.73、6 642.04，两者均在脾虚痰聚证组高表达。同上，6 642.04蛋白峰所检索出的蛋白为nAChRα-5。胆碱能系统与脾虚证之间的关系已被既往研究多次证实：陆佰荣等(2002年)运用免疫组化法探讨胆碱能神经与中医脾虚证之间的关系，结果发现脾虚大鼠模型组免疫反应明显增强；吴慧等[14]则直接将胆碱酯酶作为判断生、熟白术之枳术丸对脾虚食积证模型鼠的作用比较。本研究中6 642.04蛋白峰ROC曲线下面积为0.746，具有较强的临床诊断能力，但本研究所发现的中医两种证型间的差异蛋白峰较少，差异倍数也不及健康对照组与TD组间大，猜测可能与病例收集过程中中医证型主要靠临床医生经验判断，有一定的主观性有关。6 642.04蛋白峰在TD患儿组高表达，同时又是中医两种证型之间的差异蛋白，故推测该蛋白不仅可能成为诊断TD的潜在指标，还可能成为区分两种证型的潜在生物学标志物。对于改变以前仅靠临床医生个人经验区分证型，建立简洁、高效、客观、可重复的中西医结合辨证体系有重要意义。

目前对于TD及其中医相关证型蛋白组学研究较少，由于本研究尚处于初步研究阶段，只发现了一些差异表达蛋白峰，尚未对差异蛋白进行鉴定及进一步研究。该研究所发现的差异蛋白可能对TD发病机制研究、发现特异性诊断指标及靶向治疗药物的开发有一定的作用，并可能会为中医不同证型发病机制进行阐释、形成新的中西医结合辨证体系、进一步建立中医诊断模型有一定帮助，因此关于儿童TD蛋白组学仍需进一步研究。

[1]刘智胜.儿童抽动障碍[M].2版,北京:人民卫生出版社,2015:3-4,50-53.

[2]Amiri S,Fakhari A,Golmirzaei J,etal.Tourette’s syndrome, chronic tics, and comorbid attention deficit/hyperactivity disorder in elementary students[J].Arch Iran Med,2012,15(2):76-78.

[3]王旸,刘金同.抽动障碍的遗传学研究[J].山东精神医学,2006,19(1):69-72.

[4]American Psychiatric Association.Diagnostic and statistical manual of mental disorders (DSM-5)[M].5th ed.Arlington:American Psychiatric Pub,2013:81.

[5]汪受传,虞坚尔.中医儿科学[M].9版,北京:中国中医药出版社,2012:175.

[6]Rizzo R,Gulisano M,Pellico A,etal.Tourette syndrome and comorbid conditions: a spectrum of different severities and complexities[J].J Child Neurol,2014,29(10):1383-1389.

[7]房夏玲,高文娟,陈宁,等.抽动障碍患儿及父母心理干预的临床研究[J].中国妇幼健康研究,2016,27(3):329-331.

[8]Matsushita F,Kameyama T,Kadokawa Y,etal.Spatiotemporal expression pattern of Myt/NZF family zinc finger transcription factors during mouse nervous system development[J].Dev Dyn,2014,243(4):588-600.

[9]Foucault-Fruchard L,Antier D.Therapeutic potential of α7 nicotinic receptor agonists to regulate neuroinflammation in neurodegenerative diseases[J]. Neural Regen Res,2017,12(9):1418-1421.

[10]Miller A M,Bansal R,Hao X,etal.Enlargement of thalamic nuclei in Tourette syndrome[J].Arch Gen Psychiatry,2010,67(9):955-964.

[11]李秀丽,孙锦华,李飞,等.弥散张量成像技术研究抽动秽语综合征患儿基底节及丘脑微小结构异常[J].四川大学学报(医学版),2010,41(2):284-287.

[12]段晶晶.烟碱对发育过程中海马神经元AMPA和NMDA受体的调制作用[D].广州:中山大学,2010.

[13]Quik M,Zhang D H,Perez X A,etal.Role for the nicotinic cholinergic system in movement disorders; therapeutic implications[J].Pharmacol Ther,2014,144(1):50-59.

[14]吴慧,赵文龙,单国顺,等.生、熟白术之枳术丸对脾虚食积模型鼠作用的比较研究[J].中成药,2013,35(10):2093-2097.