布鲁杆菌病常规血清学与细菌学检测方法的临床应用比较

王馥香

(南阳医学高等专科学校第一附属医院检验科，河南 南阳473000)

布鲁杆菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁杆菌侵入机体引起的慢性变态反应性传染病，可感染人类、多种野生动物和多种家畜。布鲁杆菌病在世界上170多个国家和地区之间流行，共约500～600万布鲁杆菌病患者，每年约50万新发患者，严重威胁着人类和动物的生命健康，大大影响了畜牧业的发展和公共卫生安全，带来了巨大的经济损失[1-3]，年经济损失高达数十亿美元。目前只有澳大利亚和英国通过严格的防疫措施彻底消灭了布鲁杆菌病。布鲁杆菌病仍是全球特别是发展中国家面临的主要公共卫生问题之一，我国将人间布鲁杆菌病法定为乙类传染病。患病的猪、牛、羊为主要的传染源，牧民和兽医是主要的感染者，病原菌通过呼吸道、消化道、损伤的皮肤或黏膜等途径传播。布病的发生、发展和转归复杂，与多种疾病类似，临床上难以鉴别诊断，易被误诊[4-6]。布病的预防和控制的关键是对致病微生物的快速、准确地检测和诊断。目前用于布病的主要诊断技术有：细菌学检测、血清学检测（虎红平板凝集试验(RBPT)、平板凝集试验（RPST）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、胶体金免疫层析法(GICA)、抗球蛋白试验(Coomb's试验或 AGT)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)、核酸检测（PCR）等[7-9]。目前，布鲁杆菌病的诊断方法种类越来越多，但是至今还没有一种具有特异性、敏感性、易行、操作简单、快速等优点的检测方法。为了能够更好地对布病患者进行诊断，为临床治疗提供科学依据，本文对在本院2014年1月至2016年4月期间门诊和住院治疗的布病患者接受 RBPT、SAT、iELISA以及细菌学检测的结果进行回顾性分析，报告如下。

1 材料与方法

1．1 一般资料 142例2014年1月至2016年4月在我院门诊和住院的布病患者，以及50例健康体检者作为对照。其中男108例，年龄28～62岁，平均年龄为 38．4 岁；女 34 例，年龄 30～58 岁，平均年龄为 37．5 岁；对照组：男 23 例，年龄 24～65 岁，平均年龄为 36．2 岁；女 27 例，年龄 25～64 岁，平均年龄为36．8岁。居住地分布在全省，主要来源于畜牧业发达的农村地区，各地区之间无显著差异。临床诊断以卫生部地方病防治司颁布的布病诊断标准为依据。参考文献[4]临床症状表现为发热、高烧，伴有关节疼痛和肝脾肿大。

1．2 试验方法

1．2．1 细菌的分离与培养 使用法国梅里埃公司的全自动血培养仪Bacd/Alert 60进行门诊和住院疑似布病患者血液样本分离培养。具体操作如下：取来自于临床门诊和住院的疑似布病患者的静脉血8～10ml，接种至血培养瓶中培养。若有阳性报警，再转种至血琼脂平板培养。最后再使用法国梅里埃公司的全自动细菌鉴定仪VITEK-2进行菌株鉴定。

1．2．2 虎红平板凝集试验(RBPT)采取临床上门诊和住院的疑似布病患者以及健康体检者的静脉血1～2ml，待血液凝固后，室温 2500r/min 离心 15min，获取血清。取干净的玻片或者有凹型孔的玻片，向玻片上分别加30μl待检血清和30μl虎红平板凝集抗原，充分混匀抗原和血清，5min内判定结果。出现肉眼可见的凝集颗粒则判断为阳性，记为（+）；未见凝集颗粒则判定为阴性（-）。每次试验均设阳性和阴性对照。

1．2．3 试管凝集试验（SAT） 取5支小试管，向第1管加入2．3ml生理盐水，向第2到5管各加入生理盐水 0．5ml，将 0．2ml被检血清加入第 1 管中，充分混匀后取0．5ml至第2管并弃掉1．5ml， 充分混匀后，从第2管中取0．5ml至第3管，以此类推至第5管，第5管充分混匀后弃掉0．5ml。每管含稀释的血清均为0．5ml。然后再向第1到5管中各加入10倍稀释的试管凝集抗原 （布鲁杆菌菌体抗原）0．5ml，最后每管反应体积为1ml；待检血清稀释度从第 1～5 管分别为：1：25、1：50、1：100、1：200 和1：400。充分振荡混匀后，将试管置于37℃温箱孵育20～22h，然后与标准的浊度管进行对比判定结果。待检血清效价在1∶100(++)及以上者为阳性，1：50（+）为可疑，以下则为阴性。

1．2．4 间接酶联免疫吸附试验 (iELISA)人布鲁菌病IgG(Brucellosis IgG)间接ELISA检测试剂盒由上海美旋生物科技有限公司销售的德国IBL产品，编号：RE56821。操作方法按照试剂盒说明书进行，结果判定标准：阳性：＞12U/ml，可疑 8～12U/ml，阴性＜8U/ml。标准品阴性质控：A为1U/ml，临界质控：B 为 10U/ml，弱阳性质控：C 为 50U/ml，阳性质控：D 为 200U/ml。

1．3 统计学处理 使用 SPSS 18．0 将 RBPT、SAT、iELISA、血培养的检测结果进行处理，运用卡方检验进行统计学分析，P＜0．05时差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 细菌学检测 142例门诊和住院的疑似布病患者血培养结果均为阳性，健康对照组血培养结果均为阴性。血培养4～5d后开始阳性报警，接种至血琼脂平板上生长缓慢，2d后开始出现针尖样大小的菌落。革兰染色为阴性短小球杆菌，经全自动细菌鉴定仪VITEK-2鉴定后为马尔他布鲁菌（Br.melitensis）。

2．2 血清学检测 142例门诊和住院的疑似布病患者血清虎红平板凝集试验检测结果为：139例阳性，3例阴性，健康对照组血培养结果均为阴性，和血培养结果比较无显著差异（P＞0．05）。经试管凝集试验检测结果为：135例阳性，7例阴性，健康对照组均为阴性，与血培养结果比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。人布鲁氏菌病 IgG 检测结果为 137例阳性，5例阴性，健康对照组均为阴性，与血培养结果比较，差异不显著（P＞0．05）（表 1）；对 3 种布病常规血清学检测方法的结果进行两两比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。

3 讨论

布鲁杆菌病的诊断方法较多，包括病原学、血清学、生物化学和分子生物学等技术。其中布鲁杆菌的分离鉴定即病原学检测是布病诊断的金标准，但其具有耗时长、检出率低、培养条件苛刻、费时费力、方法复杂、实验室操作具有潜在的危险性等缺点[10-12]；因此，临床上布病的诊断以血清学检测技术为主。布鲁杆菌侵入机体后会不断地刺激机体产生凝集性抗体、补体结合抗体、调理素和沉淀抗体等，检测血清抗体对诊断病情具有重要的意义，但是该检测方法不能区别自然感染抗体、免疫抗体以及一些非布鲁杆菌的感染 （如耶尔辛氏菌0：9产生的抗体）。当前已有多种布病的血清学检测技术，且各具特色，但是都存在一定的局限性，至今仍然缺乏一种具备特异性、敏感性、检测时间短、操作简单的血清学检测方法[13，14]。目前，国内使用较多的布病检测方法有RBPT、SAT、iELISA以及全血培养等[15，16]。其中RBPT检测特异性低、结果易受测试温度和凝集时间短和人为主观判断等因素影响，不易做出准确的诊断，主要用于初筛。SAT是布病诊断的标准方法，主要用于定性。RBPT和SAT检测的抗体主要是IgM，而当人体感染布鲁杆菌后产生最多并且持续时间最长的是IgG抗体，因此这两种检测方法容易受到体内其他IgM抗体的影响。本研究对142例在2014年1月至2016年4月来我院门诊和住院的疑似布病患者以及健康对照组的血清样本进行了细菌学和常规血清学的检测。患者血培养结果为全阳性，健康对照组为全阴性；使用RBPT检测出阳性139例、阴性3例，健康对照组为全阴性，两种检测方法具有较高的符合率；该结果可能是由于RBPT可以同时检测IgG和IgM抗体，使其具有较高的阳性检出率。而SAT检测结果具有较高的假阴性率：135例阳性，7例阴性，其原因可能是与患者的疾病进程有关，疾病已过急性期，患者血清中的IgM已消失。本研究中使用的人布鲁菌病IgG(Brucellosis IgG)间接ELISA检测方法正好弥补了该缺点，检出137例阳性和5例阴性；较SAT具有较高的阳性检出率，与血培养结果具有较高的符合率。但是，由于人感染布鲁杆菌后首先体内产生的是IgM抗体，使用该检测方法则容易漏检布病的感染初期。本研究中，RBPT、SAT和iELISA检测结果与血培养检测均具有较高的符合率，分别与血培养检测结果比较差异不显著（P＞0．05）。

表1 三种布鲁杆菌病血清学检测方法结果比较

因此，综合以上检测结果，本研究中布病的四种检测方法各有优缺点。临床上只有将多种检测方法相互结合和补充，使用不同检测方法并将其结果进行复核，再结合流行病学和临床症状做出正确的诊断，从而对布病患者进行正确的用药和治疗。同时，建议临床上进行大规模的检查和筛选时，先使用具有特异性、价格低廉、敏感性较高、操作简单的检测方法，然后再使用两种或多种不同的检测方法进行复核，然后再结合流行病学和临床症状做出确诊。

[1]汪雪烨，朴春宇，金成德，等．延边地区延边黄牛布鲁氏菌病的流行病学调查[J]．安徽农业科学，2013，53(16)：7186-7187．

[2]Peker N，Turan V，Ergenoglu M，et al．Brucellosis in adolescent pregnancy case report and review of literature[J]．Ginekol Pol，2011，82(3)：226-229．

[3]Mustafa AS，Habibi N，Osman A，et al．Species identification and molecular typing of human Brucella isolates from Kuwait[J]．PloS one，2017，12(8)：e0182111．

[4]Doganay M，Aygen B．Human brucellosis：an overview[J]．Int J Infect Dis，2003，7(3)：173-181．

[5]李静，姚文海，张蕊．布鲁杆菌感染血清学与细菌学检测结果的比较[J]．现代医学，2012，40（1）：83-85．

[6]Tuon FF，Gondolfo RB．Human-to-human transmission of Brucella-a systematic review[J]．Trop Med Int Health，2017，22(5)：539-546．

[7]董文杰，解英波．布鲁杆菌病3种血清学检测方法比较分析[J]．中国卫生检验杂志，2014，24(23)：3405-3406．

[8]钟佑宏，王鹏，宋志忠．布鲁杆菌病检测研究进展[J]．中国地方病防治杂志，2012，27（2）：90-93．

[9]王晶钰，张三东，刘红彦，等．布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用[J]．动物医学进展，2010，31(S1)：5-9．

[10]高明华，张志琰，李跃．布鲁氏菌病实验室诊断研究进展[J]．中国人兽共患病学报，2010，26(1)：81-83．

[11]胡桂英，马丽，徐立青，等．5种血清学布鲁杆菌病检测方法在现场调查中的效果评估[J]．医学动物防制，2014，30（12）：1299-1301．

[12]Rossetti CA，Drake KL，Lawhon SD，et al．Systems Biology Analysis of Temporal In vivo Brucella melitensis and Bovine Transcriptomes Predicts host：Pathogen Protein-Protein Interactions[J]．Front Microbiol，2017，8：1275．

[13]钟佑宏，王鹏，宋志忠．布鲁杆菌病检测研究进展[J]．中国地方病防治杂志，2012，27(2)：90-93．

[14]Nardi Júnior G，Megid J，Mathias LA，et al．Performance of microbiological，serological，molecular，and modified seminal plasma methods in the diagnosis of Brucella abortus in semen and serum of bovine bulls[J]．Biologicals，2017，48：6-9．

[15]李树军．布鲁氏杆菌病多种实验室检测方法比较[J]．世界最新医学信息文摘，2015，15（68）：105．

[16]廖晚珍，曾令兵，胡妮娅，等．布鲁菌常规检测与结果分析[J]．实验与检验医学，2014，32(6)：670-673+687．