微生物发酵法改良大豆肽风味

豆康宁

(漯河医学高等专科学校食品营养系，漯河 462002)

大豆肽是由大豆蛋白经蛋白酶酶解而得，在食品中具有重要的应用价值。大豆肽与还原糖经过加热反应可制备肉味香精[1]。大豆肽与粉状调味品的复配具有协同作用效果[2]，使调味品的风味得到明显提高。大豆肽具有生物活性功能[3]，能促进微生物生长和发育，同时，大豆肽更容易消化吸收，具有缓解疲劳作用[4]。

大豆肽在风味上具有苦味和腥味，限制了其在食品中的推广应用。大豆蛋白疏水性氨基酸具有苦味，当大豆蛋白被蛋白酶水解成相对分子质量小的多肽时，疏水性氨基酸就会暴露出来，与味蕾发生接触，则会产生苦味。但是，当大豆肽氨基酸个数小于3时，苦味又下降了[5]。大豆肽是由大豆蛋白经蛋白酶水解制备而得，在大豆处理加工过程中，其含有的脂肪氧化酶可酶促氧化不饱和脂肪酸，产生一些挥发物质，形成特殊的豆腥味[6]。

目前，大豆肽脱苦的方法有活性炭吸附、超滤、有机溶剂提取、β-环状糊精包埋法、酶解法、微生物法、风味掩盖法，微生物发酵法常用菌种为黑曲霉[7]，这些方法对大豆肽的脱苦具有一定效果，但并不理想。本实验以大豆肽为研究对象，究了乳酸菌和酵母菌两次发酵工艺对大豆肽风味的改良效果。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆肽：平均相对分子质量1 000，质量分数92%，河南省南街村(集团)有限公司；乳酸菌(保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:1)：活菌数为1×1012个/g，安琪酵母股份有限公司；酵母菌：活性面包干酵母，活菌数为1×1012个/g，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖：食品级，山东西唐生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

RYC-111型摇床：上海福玛实验设备有限公司；X-22R型冷冻离心机：Allegra；FE20型pH计，上海阔思电子有限公司；SQ456-GC型毛细管气相色谱-质谱联用仪：美国布鲁克公司；agilent 7890A气相色谱仪，附氢火焰离子化检测器(FID)。

1.3 实验方法

1.3.1 大豆肽发酵方法[8]

在锥形瓶中，用水配置质量分数为5%的大豆肽溶液，添加大豆肽溶液3%的葡萄糖，摇匀后在高压灭菌锅中灭菌，待大豆肽溶液冷却后，在无菌操作台中接种大豆肽溶液1%的乳酸菌，然后放置在恒温摇床中发酵，发酵温度42 ℃，发酵时间0～12 h，乳酸菌发酵结束后，用高压灭菌锅对大豆肽乳酸菌发酵液灭菌。灭菌后将大豆肽乳酸菌发酵液冷却至28 ℃，在无菌操作台中接种大豆肽溶液1%的酵母菌，添加大豆肽溶液5%的葡萄糖，摇匀后放置在恒温摇床中继续发酵0～3 h，酵母菌发酵结束。

1.3.2 大豆肽溶液风味评价方法

选择12名优秀饮料感官评价员，取平均值为风味评价结果。风味评定赋分标准见表1[9]。

1.3.3 大豆肽溶液pH和总酸度的测定

采用pH计测定大豆肽溶液pH，采用酸碱滴定法测定大豆肽溶液的总酸度。具体操作方法见参考文献[10]。

表1 大豆肽溶液风味评价赋分标准

1.3.4 大豆肽溶液中乙醇含量的测定及标准曲线的建立

采用agilent 7890A气相色谱仪测定乙醇含量，色谱分析条件见参考文献[11]。用水分别配置以下不同浓度的乙醇溶液：2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.625%，建立乙醇浓度与气相色谱出峰面积的标准曲线。

1.3.5 大豆肽溶液气质色谱分析

将未发酵、乳酸菌发酵和酵母菌发酵的大豆肽溶液，用离心机分离得到上清液，然后用0.22 μm过滤膜过滤，得到GC-MS分析样品。采用SQ456-GC型毛细管气相色谱-质谱联用仪进行测定分析。采用Wiley7n.1标准谱库检索进行定性；通过气相色谱法按色谱峰面积计算各组分的相对含量。气质色谱方法参考文献[12]。

1.3.6 大豆肽含量的测定

采用双缩脲法测定大豆肽含量，见文献[13]。

2 结果与讨论

2.1 大豆肽在发酵过程中风味的变化

大豆肽溶液在乳酸菌发酵和酵母菌发酵发酵过程中风味变化见表2所示。

表2 大豆肽在发酵过程中风味的变化

从表2可知，乳酸菌发酵8 h时，大豆肽溶液风味最好。随着乳酸菌的发酵，会产生酸类、酯类等物质，使大豆肽溶液的苦味和腥味下降，且具有爽口的乳酸酸味[14]。酵母菌发酵2 h时，大豆肽溶液风味最好。随着酵母菌的发酵，会产生醇类、酯类等物质，使大豆肽溶液的苦味和腥味下降，且具有乙醇的杀口感[15]。

本实验所配置的5%的大豆肽溶液中，发酵结束后，测定大豆肽的含量为3.2%，大豆肽含量下降36%，这部分大豆肽经过微生物发酵，被微生物消耗或者分解成氨基酸。目前，大豆肽饮料中常用的脱苦方法是风味掩盖法，即添加糖、酸、酒精等调味剂来掩盖大豆肽的不良风味，当溶液中大豆肽含量低于1%，具有较好的效果，但是当大豆肽添加量超过1%时，该方法效果较差。

2.2 大豆肽在乳酸菌发酵过程中pH和总酸度的变化

由图1可知，大豆肽溶液pH随着乳酸菌的发酵不断下降，总酸度不断增加。发酵12 h后，pH下降到3.8，总酸度上升到2.1 g/L。这主要由乳酸菌发酵产生酸类物质的结果[16]。

图1 大豆肽溶液在乳酸菌发酵过程中pH和总酸度的变化

2.3 大豆肽在酵母菌发酵过程中乙醇含量的变化

乙醇溶液标准曲线方程式为Y=12 648.029 9X-91.032 609，R2=0.999 98。

大豆肽溶液在酵母菌发酵的过程中，乙醇含量的变化如图2所示。

图2 大豆肽发酵过程中乙醇含量的变化

由图2可知，大豆肽溶液在酵母发酵的过程中，开始发酵时，乙醇含量增加幅度较小，发酵1 h后，乙醇含量增加幅度较大。这是由于酵母在前期发酵主要以有氧发酵为主，产生氧气和二氧化碳。发酵后期，溶液中氧气消失，酵母菌以无氧发酵为主，产生乙醇和二氧化碳[17]。

2.4 大豆肽发酵前后风味物质的变化

未发酵的大豆肽、乳酸菌发酵的大豆肽、酵母菌发酵的大豆肽的GC-MS总离子流图分别见图3、图4和图5。GC-MS出峰物质信息见表3～表5。

图3 未发酵大豆肽溶液GC-MS总离子流图

图4 大豆肽溶液乳酸菌发酵8 h时GC-MS总离子流图

图5 大豆肽溶液酵母菌发酵2 h时GC-MS总离子流图

表3中出峰物质占比重较大的有7种，占总出峰物质比例62.68%，分别是己醛、2-庚酮、甲基乙基甲酮、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、戊酸，这些物质都具有刺激性香味。其他物质占37.32%，其中部分物质具有异味，如1-甲基萘、吲哚等。大豆肽具有腥味，这种腥味不仅是由以上7种主要成分造成，因为这7种物质所占比例为仅为62.68%，这种腥味可能由所有挥发物的气味合成而呈现出来[13]。

表4中的主要气味成分物质有9种，分别是乙酸乙酯、2-羟基丙酸乙酯、3-甲基-2-丁酮、正己醇、乙酸、苯甲醛、3-甲基丁酸、4-甲基戊酸、己酸，这些物质占总出峰物质57.475%，这些主要成分中，有4种有机酸，是大豆肽发酵溶液呈酸味的主要物质。这些主要成分中还含有酯类、醇类、酮类物质，具有一定的香味。因此，大豆肽溶液经过乳酸菌发酵后，物质成分发生较大的变化，大豆肽的苦味和腥味变得较轻，且具有爽口的酸味。

表3 未发酵大豆肽溶液气质色谱出峰物质分析

表4 大豆肽乳酸菌发酵溶液气质色谱出峰物质分析

表5 大豆肽酵母菌发酵溶液气质色谱出峰物质分析

表5中的主要气味物质成分有5种，分别是乙酸乙酯、乙醇、2-甲基-1丙醇、异戊醇、苯乙醇，这5种物质占出峰总物质的98.05%，占比重较大。这5种物质中，乙酸乙酯具有水果香味，其他4种醇类物质具有酒香味，因此大豆肽气味醇香。在口感上，有乳酸菌发酵的酸味物质，有由酵母菌发酵产生的具有杀口感的醇类物质，综合口感呈酸爽的杀口感。经过酵母菌发酵后，大豆肽溶液的苦味和腥味消失，风味得到明显改善。

3 结论

在5%的大豆肽溶液中，添加1%的乳酸菌，3%的葡萄糖，在42 ℃下发酵8 h时，大豆肽的风味最佳。大豆肽溶液在乳酸菌发酵的过程中，pH不断下降，总酸度不断增大。乳酸菌发酵灭菌后，添加1%的酵母菌，5%的葡萄糖，在28 ℃下发酵2 h时，大豆肽的风味最佳。大豆肽在酵母菌发酵的过程中，乙醇含量不断增加，大豆肽苦味和腥味消失，口感具有酸爽的杀口感，气味具有酒香味，大豆肽风味得到明显改善。因此，乳酸菌和酵母菌二次发酵工艺法是大豆肽风味改良的有效途径。

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