大豆在萌发过程中的铁锌营养强化

余赛西，胡广林，李凯，刘金芳，唐琦

（热带生物资源教育部重点实验室，海南大学材料与化工学院，海南海口 570228）

大豆含有丰富的矿物质元素和营养物质，在我国的消费量也较大，而且豆类及制品在膳食中经常搭配使用，是人体内微量元素很重要的膳食来源。采用常规食品加工方法对微量元素即营养物质的损失较大，找到合适的途径增加谷物及豆类中微量元素的营养价值，就能够在改善微量元素缺乏性营养不良状况（隐性饥饿）方面发挥重要作用。

萌发是有利于豆类[1]营养价值改善的一种处理方式，王莘[2]将大豆、绿豆和黑豆3种豆类萌发期的微量元素进行分析，发现其在萌发期矿物质元素含量除钾以外，其他均高于未萌发种子，当芽萌发到3.0 cm时，含量达到最大值。在豆类萌发过程中添加营养添加剂进行生物强化，能够提高豆类营养物质的含量。Zielińskadawidziak等[3]用等浓度梯度的FeSO4强化大豆，发现大豆中脂质、维生素 E、β-胡萝卜素有显著提升。Barrameda-Medina等[4]在水培过程中用ZnSO4强化甘蓝，发现其可食部分锌、总氨基酸、多酚含量和多种合成酶活性的提升。

铁和锌是世界范围内最盛行的人类微量营养素缺乏中的两个矿质元素。对于植物，铁元素是参与生物固氮，植物激素合成、DNA合成等的辅因子，铁的缺乏会对植物的生理学产生影响，造成营养缺失[5]。Zou等[6]用ZnSO4对大豆进行浸种和强化，锌在大豆可食部分的含量和生物利用率显著提高。Manvesh[7]用铁强化后的珍珠栗喂食大鼠，发现有贫血症的大鼠体内铁含量升高，用铁和维生素A同时强化后的珍珠栗投喂，铁的生物利用率显著提高。目前对于豆类的营养强化多使用单一强化剂，对于豆类在萌发过程中进行铁和锌同时强化的少有报道。Guillénmolina等[8]将Fe-EDDHA与Zn-EDTA以不同比例混合，作为营养强化剂强化鹰嘴豆，发现不同比例的营养强化剂对其产量、微量元素含量和抗氧化活性无显著差异。铁锌强化对于同时缺铁和锌，或缺其中之一的豆类和人群有重要意义。以大豆种子铁蛋白为代表的植物铁蛋白被认为是未来的一种新型天然的功能性补铁因子[9]，吸收较稳定，不受植酸、单宁等抗营养因子的影响，在食品加热（煮沸）过程中保持稳定的α螺旋结构（一部分在 80 ℃开始变性）[10]。将铁蛋白含量纳入大豆生长评价指标能够更加直观地描述其营养价值。

本实验通过用铁锌营养强化剂对大豆进行浸种和萌发，研究不同强化剂对大豆微量元素和营养物质的影响，为大豆成为人体补铁补锌的膳食来源并为其进一步在食品领域的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验原料

‘中黄24号’，当年产。购于中国农业科学院作物科学研究所。

1.2 试验试剂

硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，硫酸锌（ZnSO4·7H2O），浓硝酸，浓硫酸，次氯酸钠（NaClO），过氧化氢（H2O2），高锰酸钾(KMnO4)，过硫酸钾(K2S2O8)，硫氰酸钾(KSCN)，DPPH（Macklin），甲醇。试验中所用其余化学试剂均为国产分析纯；实验用水为超纯水，电阻率18.2 ΜΩ·cm。

1.3 主要仪器设备

人工气候箱（南京实验仪器厂HSR025），离心机（Sigma 3-30K），恒温振荡器（江苏国华THZ-82），超声波清洗仪（南京先欧仪器制造有限公司XO-5200DTS），鼓风干燥箱，分析天平，火焰原子吸收分光光度仪（北京普析TAS-990），紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司752N)。

1.4 试验方法

1.4.1 大豆的萌发

1.4.1.1 选种

选取优质的大豆种子，要求籽粒饱满，色泽淡黄，无破损，百粒重约30 g。

1.4.1.2 消毒

称取15 g大豆干种子，用超纯水清洗表面灰尘和细菌，置于1% NaClO中浸泡15 min。消毒结束后用超纯水将大豆表面清洗干净。

1.4.1.3 浸泡

将消毒后的大豆种子置于超纯水中，置于25 ℃人工气候箱中避光浸泡10 h。

1.4.1.4 萌发

1.4.2 大豆的铁强化

配制质量浓度分别为0、5.6、11.2、16.8、22.4、28、33.6、39.2、44.8、50.4、56 μg/mL 的 FeSO4营养强化剂，将大豆种子选种消毒（与1.4.1一致）后，分别用以上浓度的铁营养剂将大豆种子进行浸泡和萌发。

1.4.3 大豆的锌强化

配制质量浓度分别为10、20、30、50、60、70、80、90、100 μg/mL的ZnSO4营养强化剂，强化方式与1.4.2一致。

1.4.4 大豆的铁锌强化

配制铁:锌浓度分别为5.6:10、11.2:20、16.8:30、22.4:40、28:50、33.6:60、39.2:70、44.8:80、50.4:90、56:100的营养强化剂，强化方式与1.4.2一致。

1.4.5 样品的制备

大豆萌发处理5 d后，置于60 ℃恒温干燥24 h，玛瑙研钵研磨成粉，过60目（0.25 mm）标准筛，装入样品袋，-4 ℃冷藏，待测。设置大豆未萌发干样为空白组，超纯水萌发大豆为对照组，1.4.2、1.4.3、1.4.4处理后的大豆干样分别编号为实验a组、实验b组、实验ab组。

一般地,零件配套生产问题可以描述为某企业生产一种产品，它需要m种零件按某种数量比例(c1∶c2∶…∶cm)配套组装而成，可以加工这些零件的设备有n种，每种设备又有pk(k=1,2,…,n)台，第i种设备生产第j种零件的日生产能力为qij(件/台·日)，试制定使该产品产量最大的生产方案．

1.4.6 铁锌元素的分析测定

称取样品0.3 g加入消化罐，加入浓硝酸2 mL过夜，进行预硝化，再加入8 mL H2O2，置于150 ℃下3 h，用5%硝酸定容至50 mL，火焰原子吸收分光光度计测定铁锌含量。

1.4.7 富集系数的分析

富集系数（Concentration Factor，CF）[11]用来描述强化大豆对铁、锌的富集能力。在此实验中定义为的微量元素（铁、锌）在大豆中的富集量与培养液中相应微量元素（铁、锌）含量的比值。公式如下：

1.4.8 铁蛋白的测定

提取参照Niedzielski[12]的方法，称取样品0.5 g，加入5 mL 2 moL/L的盐酸，80 ℃振荡提取60 min，过滤后将上清液合并，定容至50 mL。

铁标准溶液制备：0.4979 g FeSO4·7H2O溶于水，加入5 mL浓硫酸，加热至微热，用2% KMnO4滴至最后一滴不褪色，定容至1000 mL，为100 μg/mL铁贮备液，稀释至10 μg/mL。加入上述铁标液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，定容至25 mL，470 nm下分光光度计测其吸光度绘制标准曲线。

无机铁（Fe3+）测定：取1 mL提取液于10 mL比色管，加入500 μL浓硫酸，2 mL、2% KSCN，200 μL、20% K2S2O8，定容至总体积为5 mL，反应10 min，470 nm下测其吸光度。

铁蛋白的计算公式[3]如下：

铁蛋白(以Fe含量计，ng/mg)=总铁-无机铁

参考Xia[13]的方法，取样品1 g，用10 mL体积分数为70%的甲醇溶液超声提取1 h，14000 g下离心30 min，过滤，上清液合并，甲醇定容至50 mL。提取过程温度为4 ℃。

测定时参照叶汉侠[14]的方法，提取液8 mL加入10 mL比色管，加入2 mL甲醇作为对照组，加入2 mL DPPH为实验组，2 mL DPPH与8 mL甲醇作为空白组，避光条件下反应30 min，517 nm下测吸光度。

1.4.9 数据分析

所有样品的测试重复 3次；测试结果以平均值±标准偏差表示结果用采用SPSS 22.0和Origin 9.0进行数据分析，并使用SPSS 22.0统计软件进行差异显著性分析（Duncan多重比较，p=0.05）。

2 结果与分析讨论

2.1 铁、锌营养剂对大豆中铁锌含量的影响

如图1所示，大豆未萌发种子中的铁锌含量分别为50.25、46.23 μg/g。萌发过程提高了大豆中铁、锌含量，分别提高了59.23%、66.47%，3种营养强化剂的添加均提高了大豆萌发后铁、锌含量。

图1 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的铁含量Fig.1 Total iron content (μg/ g dry matter) in seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

图2 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的锌含量Fig.2 Total zinc content (μg/g dry matter) in seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

如图1a所示，对大豆萌发过程中铁含量的促进作用由大到小分别为实验ab组>实验a组>对照组。对大豆萌发过程中锌含量的促进作用由大到小分别为实验b组>实验ab组>实验a组>对照组。

FeSO4作为营养强化剂能显著提高大豆中铁含量，在营养剂中铁浓度在16.8～33.6 μg/mL时大豆中铁含量达到最高，为 152.63 μg/g，比空白组增加了203.74%，比对照组增加了92.79%，大量研究表明铁的添加能够改善植物缺铁现状[15]，并能增加植物干重[16]。之后铁含量开始下降，萌发中的大豆对铁离子的吸收受到阻碍，说明高浓度的铁离子使萌发过程受到抑制，但萌发仍继续进行[3]。

当FeSO4中铁浓度达到44.8 μg/mL，实验a组的铁含量开始低于对照组。如图1b所示，FeSO4能够很大程度降低大豆中锌的吸收。相同锌浓度下添加铁离子后，实验 ab组大豆中锌含量比实验 b组降低18.65%～52.96%。祝美云等[17]用浓度为 600 μg/g的FeSO4、ZnSO4培养苜蓿，研究发现过量的铁可降低苜蓿中锌的吸收和利用，与本实验结果表现一致。Kaya等[18]先后用培养液加Zn2+、叶面喷洒Fe-EDTA的方法处理番茄，发现铁的添加能够缓解植物由于高浓度的锌产生的锌中毒现象，说明铁的添加能够抑制植物对锌的吸收。

章艺等[19]研究铁胁迫下大豆叶肉细胞超微结构的变化，发现在50 μg/g Fe处理下，大豆叶绿体严重膨胀，外膜破损，线粒体空泡化，说明过量的铁对大豆叶肉细胞内膜系统结构造成损害。推测本实验中锌减少的另一个原因是铁已过量，对大豆细胞造成铁中毒，呼吸作用及其他生理功能受损，导致对锌的吸收受影响。

ZnSO4作为营养强化剂能够提升大豆中的锌含量，如图2所示，在营养剂中锌浓度在40～70 μg/mL时大豆中锌含量达到最高，为523.00 μg/g，是空白组的11.3倍，对照组的6.7倍。如图1，锌离子与铁离子对大豆种子的萌发均具有低浓度下的刺激效应和高浓度下的抑制效应[16]，营养强化剂中锌浓度在70～100 μg/mL，大豆中锌含量随浓度升高而降低。如图1a所示，实验ab组铁含量显著高于实验a组，说明ZnSO4的添加能够促进铁强化大豆对铁的吸收。同时实验 b组中铁含量无明显变化，说明其单独作用时，对大豆的铁吸收无显著影响。

如图1所示，FeSO4与ZnSO4同时强化能够显著提高大豆中的铁含量，锌的添加对大豆铁含量达到最高值时对应的铁浓度范围无影响，最高可达到276.67 μg/g，比空白组高450.59%，比实验a组达到的最高铁含量高81.27%，之后大豆中铁含量开始下降，在强化铁含量为44.80 μg/mL时达到最低点，再次线性上升，由于实验a组和实验ab组在同一范围的铁浓度下曲线趋势一致，推测是由于铁浓度过高引发铁中毒，植物细胞膜破裂，铁离子外泄导致浓度直线上升。

图1所示，FeSO4的添加对大豆锌的吸收有抑制作用，能够降低铁强化大豆中锌含量的19.22%～57.78%。如图2，ZnSO4的添加能够促进铁的吸收，提高了大豆中铁含量的6.70%～81.27%，由于实验ab组营养强化剂的盐浓度均高于实验a、b组，也可能导致细胞膜提前破裂，铁离子外泄。Verma[20]等用不同浓度的ZnSO4和FeSO4同时处理水稻，发现锌的添加不仅能降低稻谷本身谷粒和叶面中的铁，也能在铁强化稻谷时抑制铁的吸收。

2.2 铁、锌营养剂对大豆萌发铁锌富集的影响

如图3、4所示，实验组的铁、锌富集系数随着营养强化剂的浓度的升高呈现降低趋势，说明高浓度的营养强化剂会降低对元素的富集能力。如图3所示，实验 ab组对铁的富集能力较强，富集系数为2.23～16.99，实验a组对铁的富集系数为1.09～15.63。说明锌离子的加入能够提升大豆对铁元素的富集能力。实验a组中铁浓度为56 μg/mL大豆铁富集系数为1.09，表明大豆对铁元素有极弱富集用。如图4所示，实验b组对锌的富集能力高于实验ab组，富集系数为3.26～9.56，实验ab组对锌的富集系数为1.65～7.73，说明铁离子添加对大豆锌吸收富集能力有抑制作用。

图3 不同浓度铁锌营养强化下大豆对铁的富集系数Fig.3 Concentration coefficient of Fe within sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

图3 不同浓度铁锌营养强化下大豆对锌的富集系数Fig.4 Concentration cofficient of Zn within sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

2.3 铁、锌营养剂对大豆铁蛋白的影响

如图5所示，大豆干种子的铁蛋白含量为40.01 ng/mg（以 Fe计）。在萌发过程中铁蛋白降低了约10.37%，降解用于种子萌发和幼苗早期生长[21]。3种营养强化剂对大豆萌发过程中铁蛋白的含量影响差异较大。在营养剂中铁浓度在16.8～33.6 μg/mL时实验a、ab组大豆中铁蛋白含量达到最高，分别为 101.63、234.57 ng/mg，与图1中大豆铁含量达到最高的浓度范围对应一致，细胞质内铁离子的升高会引起铁蛋白的积累[3]。

图5 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的铁蛋白含量Fig.5 Ferritin content (Fe, μg/mg dry matter) in seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

实验a、ab组铁蛋白的下降是高浓度的铁离子对大豆生理造成损伤的标志。外源铁离子的升高让植物铁蛋白含量降低，暗示铁平衡被破坏，植物发生氧化应激[22]。实验b组的铁蛋白含量均低于大豆干样，铁蛋白含量为2.56～22.03 ng/mg，表明ZnSO4对大豆铁蛋白的积累有抑制作用。

目前对于铁蛋白的表达很多机理都未明确[23]，植物对于过量的铁表达铁蛋白的机制有多种推测，其中Briat[5]猜想，铁蛋白的积累是保护植物体中活性氧，结合自由铁离子的一种储存方式。实验a、ab组有外源铁离子加入，大豆吸收后可能一部分结合活性氧生成铁蛋白储存。实验b组无铁离子的添加，但环境中盐浓度高于对照组，对大豆生长造成盐胁迫，造成酶活性降低等生理损伤，抑制铁蛋白的合成[23]。

2.4 铁、锌营养剂对大豆抗氧化活性的影响

图6 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

如图6所示，大豆的抗氧化活性在本实验中用甲醇提取物对 DPPH的清除率表示，三组实验组的DPPH清除率均高于大豆干样，与对照组并无显著大小关系，整体呈现低浓度促进高浓度抑制的规律。实验组 DPPH清除率最高可以达到56.82%、69.88%和71.36%。推测由于培养液中铁离子的升高导致大豆内铁蛋白的增加，抑制细胞内活性氧的产生[3]，抗氧化活性升高。在铁、锌有毒金属的高浓度环境下，大豆细胞内发生氧化应激，代谢产生大量活性氧和自由基，抗氧化活性降低。

2.5 铁、锌营养剂对大豆微量元素的影响

如表1所示，在低浓度水平下（5.6～11.2 μg Fe/mL，10～20 μg Zn/mL），对于大豆铁含量，实验a组与实验ab组营养剂类型上无显著差异（p>0.05），分别将大豆中铁元素含量提高了93.03%、105.97%（对比空白组，下同），但与实验b组差异性显著（p<0.05）。在浓度范围较高的水平下（16.8～28.0 μg Fe/mL，30～50 μg Zn/mL），3种营养强化剂对大豆铁含量的提升程度表现显著性差异（p<0.05），且促进作用由高到低分别是实验ab组>实验a组>实验b组，最高提升了449.25%。在更高浓度水平下（33.6～39.2 μg Fe/mL，60～70 μg Zn/mL），锌的添加对于大豆铁强化不形成显著性影响（p>0.05）。

在最高浓度范围水平下（44.8～56.0 μg Fe/mL，80～100 μg Zn/mL）实验 a组与 b组无显著性差异（p>0.05），二者与实验ab组差异性显著（p<0.05），此时很可能由于细胞膜破裂导致的含量上升。所以 3种营养强化剂在不同浓度呈现的显著性差异不同。

如表2所示，在低浓度水平下（5.6 μg Fe/mL，10 μg Zn/mL），实验a组与实验ab组对大豆锌含量有显著性差异（p<0.05），分别提高了大豆锌含量的165.72%和66.77%。在较高浓度范围水平时（11.2～56.0 μg Fe/mL，20～100 μg Zn/mL），3 种营养强化剂之间呈现显著性差异（p<0.05），由大到小分别为实验b组、ab组、a组。

如表3所示，3种营养强化剂对大豆中铜含量的无明显影响。当强化剂中铁浓度为22.4 μg/mL时，大豆中铜含量较高，实验a组、ab组分别达到13.25、13.00 μg/g。Fasaei[24]等用含有 0、5、10 mg Zn/kg ZnSO4和1、5、10 mg Fe/kg Fe-EDDHA的土壤栽培鹰嘴豆，发现锌的添加对鹰嘴豆芽中的铜含量无显著影响。

表4中所示，实验a组与实验b组在低浓度水平（5.6～11.2 μg Fe/mL，10～20 μg Zn/mL）无显著性差异（p>0.05）。较高浓度水平下（16.8～56.0 μg Fe/mL，30～100 μg Zn/mL）3种营养强化剂呈现显著性差异（p<0.05）。

对大豆中锰含量的抑制作用有大到小分别是实验ab组>实验b组。实验ab组对锰含量的抑制作用能够降低 91.32%，实验 b组中的大豆锰含量范围为14.67～19.33 μg/mL，实验a组对大豆中锰含量的提升范围为8.56%～42.77%。Fasaei等[24]发现铁强化鹰嘴豆会导致豆芽营养失衡，对锰的吸收降低。

铁、锌和锰在植物内吸收和转运载体上存在竞争关系，如小麦对铁和锰的需求高于锌[17]，以上3种方法对铁、锌、铜、锰四种微量元素的影响，是由于大豆内各微量元素之间的协同拮抗作用，与生物酶等活性物质互相作用的结果。

表1 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的铁含量Table 1 Total iron content (μg/ g dry matter) in seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 andZnSO4

表2 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的锌含量Table 2 Total zinc content (μg/g dry matter) in seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

表3 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的铜含量Table 3 Total copper content (μg/g dry matter) in seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations of FeSO4 and ZnSO4

表4 不同浓度铁锌营养强化下大豆及其干种子的锰含量Table 4 Total manganese content (μg/g dry matter) in seeds and sprouted soybean seeds germinated in different concentrations FeSO4 and ZnSO4

3 结论

研究结果表明，FeSO4与ZnSO4联合作为铁锌营养强化剂能够提升大豆中的铁、锌含量。相同的铁、锌浓度下，大豆铁含量由高到低的强化方法为FeSO4+ZnSO4，FeSO4，ZnSO4，锌含量由高到低的强化方法为ZnSO4，FeSO4+ZnSO4，FeSO4。FeSO4的添加对大豆锌的吸收有抑制作用，能够降低铁强化大豆中锌含量的19.22%～57.78%。ZnSO4能够促进铁的吸收，提高了大豆中铁含量的6.70%～81.27%，在一定浓度范围（30～60 μg Zn/mL）内提升大豆铁蛋白的含量。ZnSO4单独作用于大豆时，对大豆的铁吸收无显著影响，且抑制铁蛋白的合成。3种营养强化剂对大豆萌发过程中铜元素无显著影响，FeSO4能够提升大豆中锰含量，FeSO4与ZnSO4同时添加时，锰元素含量降低。3种营养强化剂对大豆萌发后抗氧化活性的影响并无显著差异（p>0.05）。本实验表明，5.6～56 μg Fe/mL，10～100 μg Zn/mL的铁锌营养强化剂浓度能够提高大豆萌发过程中的铁、锌含量，铁、锌互相作用影响大豆对其余微量元素的吸收及其抗氧化活性。

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