川牛膝不同组分体内抗凝血活性研究

孟宪群，梁珊珊，赵奕，王秋红，匡海学*

(1.黑龙江中医药大学，北药基础与应用研究教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

现今人们生活水平日益提高,饮食也不断的丰富，而丰富的饮食里含有大量高脂蛋白的物质，导致血栓患者不断加多[1-2]。治疗血栓的主要方法之一是采用抗凝血药物，但抗凝血药物也有一定副作用，例如容易使血小板减少[3-4]，因此急需要研究和开发安全有效的抗凝血药物。提取天然产物中具有抗凝血作用的有效成分，是研究抗凝药物的研究热点，具有周期短、成本低并且低毒的优点[5]。

川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)为苋科植物的干燥根，为著名川产道地药材。川牛膝药物最早在《仙授理伤续断秘方》中出现，具活血化瘀之功效[6-7]。由于其具有镇痛，免疫增强剂，抗肿瘤，抗炎，抗炎等多种药理活性，已被列入《中华人民共和国药典》[8]。川牛膝多糖是从川牛膝的根中提取的一种生物活性多糖，具有低毒、调节免疫、降血糖、降血糖、抗衰老、促进红细胞免疫功能[9]、抗肿瘤、减轻环磷酞胺Cy所致外周白细胞减少等功能[10-11]。目前，国内外对川牛膝多糖抗凝血活性还未有研究报道。因此，本文以川牛膝为原料，提取川牛膝多糖，研究水和不同浓度乙醇提取的粗多糖对小鼠全凝血时间(CT)、出血时间(BT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APPT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)的影响，探讨川牛膝多糖对体内抗凝血的作用，为川牛膝的药理活性开发和应用提供更多开发的可能性。

1 材料与方法

1.1 试药

川牛膝在黑龙江省哈尔滨市药材公司采购，经黑龙江中医药大学药学院中药资源学教研室王振月教授鉴定为苋科植物川牛膝的干燥根。

1.2 动物

ICR小鼠，体质量18～22 g，合格证号SYXK(黑)2016001，黑龙江中医药大学安全评价中心提供。

1.3 试剂

凝血酶时间(TT试剂8×4.0 ml，北京普利生仪器有限公司，批号1520908011)；凝血酶原时间(PT试剂10×4.0 ml，北京普利生仪器有限公司，批号163201022)；活化部分凝血酶时间(APTT试剂5×4 ml，北京普利生仪器有限公司，批号152801022)；纤维蛋白原(FIB试剂4×5.0 ml，北京普利生仪器有限公司，批号162802011)；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。

1.4 仪器

旋转蒸发仪(上海爱明仪器有限公司)；C2000-A高性能血凝仪(普利生集团)；ALPHA 1-4 LD plus型冷冻干燥机(德国Martin Christ 公司)；UV-1601型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；KQ-500DB型超声波提取仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.5 川牛膝粗多糖的制备

称量1 kg的川牛膝粗粉，用水、20%乙醇、50%乙醇作为提取剂，浸泡至过夜，采用回流法提取，共3次，60 min/次，获得的提取液过滤，之后合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩滤液，冷却后，加入乙醇进行醇沉，使乙醇终浓度是80%，在4℃下放24 h，3 000 r/min离心10 min，多糖沉淀，在低温的情况下使溶剂挥干，干燥多糖。通过苯酚硫酸法测定多糖含量，葡萄糖为对照品，在490 nm波长下测定多糖的含量[12]。结果水提多糖66.9%、20%乙醇提多糖53.9%、50%乙醇提多糖39.7%。

1.6 实验方法

ICR的小鼠70只，分为10组，每组7只，分别为水提取川牛膝多糖高、中、低剂量组，20%乙醇和50%乙醇提取的粗多糖高、中、低剂量组和空白组。将川牛膝粗多糖配成16、8、4 g/kg浓度，小鼠按高、中、低剂量灌胃，空白组小鼠给予同体积生理盐水，连续3 d。

1.7 小鼠全凝血时间(clotting time，CT)的测定

最后一次给药1 h后，CT测定利用玻片法，而且是每组7只小鼠都进行测定[13-14]。在小鼠尾尖3 mm处横剪断并且在载玻片上，滴直径为5 mm的血滴， 马上用秒表记录时间，每一个10 s就用清洁的针头从血滴边缘向里轻轻挑起一次，观察有无血丝被挑起，从采血开始到挑起血丝为止，所需要的时间即为CT。

1.8 小鼠出血时间(BT)的测定

腹腔注射大约20 min后，在小鼠尾尖3 mm切断，当有血流出时刻，开始用秒表计时并且每隔30 s，用滤纸在尾尖检测1次血滴，没有血溢出为止，记录BT[14]。

1.9 凝血4项的测定

小鼠最后给药的1 h后，取血，精密量全血0.9 mL并且马上加抗凝剂，放到离心管，混匀后3 000 r/min离心15 min，需在4 h内按照试剂盒说明书测定PT、APTT、TT和FIB值。

1.10 统计学处理

2 结果

由表1可知，水和20%乙醇提取川牛膝粗多糖具有明显抗凝血效果，在高剂量组和空白组的比较发现水提取的粗多糖抗凝血的效果最好(P<0.01)。表2和表3测定的凝血4项结果发现水和20%乙醇提取粗多糖，高剂量组与空白组比较能明显延长CT、BT、APTT和TT时间，FIB值降低，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，对PT值无显著影响。但是高、中、低剂量组的50%乙醇提取的粗多糖对CT、BT、PT、APTT和TT延长作用不明显，也无降低FIB的作用。川牛膝水和20%乙醇、50%乙醇提取的粗多糖抗凝血活性测定结果见表1～3。

表1 体内抗凝血活性检测结果

注：与空白组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

表2 川牛膝多糖对小鼠的APTT，PT，TT的影响

注：与空白组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

表3 川牛膝多糖对小鼠的FIB的影响

注：与空白组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

3 讨论

川牛膝具有活血化瘀、疏通经络的作用，可以防治血管内栓塞或血栓形成的疾病，预防中风等[15]。检测抗凝活性的前提条件是凝血时间(CT)和出血时间(BT);而APTT常用来检测内源性凝血系统和筛选实验;PT通常用来测定外源性凝血系统的一种理想并且经常使用的筛选试验;TT是鉴定纤维形成的一种实验方法;FIB纤维蛋白原是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质[16-17]。因此利用这六项指标来探讨川牛膝粗多糖是否具有体内抗凝血的作用。通过水、20%乙醇、50%乙醇提取，乙醇醇沉之后的粗多糖得率分别为21.3%、15.6%、12.3%。通过苯酚硫酸法测定多糖的含量结果水提粗多糖66.9%、20%乙醇提粗多糖53.9%、50%乙醇提粗多糖39.7%。由结果来看水提取的多糖含量是最高的，并且川牛膝水提取的粗多糖能显著延长CT、BT、APTT和TT时间，降低FIB值，并且随着浓度的加大，效果越加明显,但是对PT无明显的影响。20%乙醇提取的粗多糖也可以使CT、BT、APTT和TT时间延长，降低FIB值，PT无明显的影响，同样具有浓度依赖性,但是不如水提取的粗多糖效果好。APTT和TT的时间被延长说明川牛膝水提取和20%乙醇提取的粗多糖在体内起到抗凝作用的途径是通过使内源性凝血途径和共同凝血途径被激活完成的。与以前报道其他多糖抗凝血作用机制相似[18-20]。降低了FIB的时间，说明川牛膝多糖体内抗凝与血浆蛋白原有关联。而高、中、低剂量组50%乙醇提取的多粗糖对CT、BT、PT、APTT、TT延长作用不明显，也没有降低FIB值,表明50%提取粗多糖不具有抗凝活性。

本次实验首次以川牛膝作为原材料，用水和乙醇作为提取溶剂得到提取物，来初步判断不同溶剂和浓度提取的川牛膝多糖在体内抗凝血效果，通过苯酚硫酸法测定不同溶剂和浓度提取的川牛膝多糖，发现水提取的川牛膝多糖含糖量是最高的，并且也是体内抗凝效果最好。但水提取的多糖尽管含多糖量最高，但是也会把一些蛋白类、皂苷类等一些物质提取出来，所以川牛膝多糖是否为体内抗凝血活性成分还有待进一步研究。

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