川牛膝和怀牛膝化学成分提取分离及含量测定研究进展

梁林辉 杜翠华 梁大伟

摘要 川牛膝和怀牛膝为道地药材，临床使用广泛，疗效显著，其成分三萜皂苷类、甾酮类、多糖类生物活性显著，为其发挥药效的主要物质。总结国内外公开发表的相关文献，对川牛膝和怀牛膝中三萜皂苷类、甾酮类、多糖类成分的提取分离及含量测定研究进行综述，以期为其有效成分进一步研究及开发提供参考。

关键词 川牛膝;怀牛膝;化学成分;提取分离;含量测定

中图分类号 R 284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）09-0012-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.004

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The Research Progress on Extraction and Determination Methods of Chemical Constituents in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides

LIANG Lin-hui， DU Cui-hua， LIANG Da-wei

（Ya’an Polytechnic College， Ya’an， Sichuan 625000）

Abstract Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides are genuine crude drugs. It’s clinical application is extensive， and the activated ingredients are triterpenoid saponins， sterone compounds and polysaccharide. This paper summarizes the extraction and determination methods of chemical constituents in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides， and provides a reference for its further development and utilization

Key words Cyathulae Radix;Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides;Chemical constituent;Extraction;Determination

川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，是川产道地药材，主要产自雅安市天全县、宝兴县、汉源县以及乐山的金河口区，重庆、云南、贵州亦有分布;怀牛膝为河南省焦作市特产，是中国国家地理标志产品。它们具有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋的功能，用于经闭癥瘕、胞衣不下、跌扑损伤、风湿痹痛、足痿筋挛、尿血血淋治疗，临床疗效显著。化学成分主要有三萜皂苷类[1]、甾酮类[2]及多糖类[3]，有少量的生物碱、黄酮类等成分。近年来，关于川牛膝和怀牛膝的研究主要集中于化学成分鉴定及药理学研究，其有效成分的提取、分离纯化及含量测定研究较少，该研究从主要有效成分三萜皂苷類、甾酮类、多糖类的提取分离及含量测定方面进行综述，以期为牛膝的进一步开发利用提供借鉴。

1 三萜皂苷

1.1 提取分离方法

三萜皂苷类化合物是川牛膝主要成分之一。罗懿钒等[4]综述了牛膝中有效成分，发现39种三萜皂苷类化合物，其中7种为川牛膝中含有，主要为齐墩果酸型皂苷。王丽景[5]采用正交试验考察了乙醇浓度、料液比、提前时间、提取次数等因素对牛膝中皂苷提取效果的影响，最优工艺为乙醇浓度为80%、料液比1∶8、回流提取2次，每次3 h，牛膝总皂苷含量可达1.889 mg/mL，大孔树脂吸附处理，含量可达60%。王俊等[6]分别以甲醇、乙醇为提取溶剂，比较超声法、回流提取法和索氏提取法，发现乙醇提取效率明显高于甲醇，超声提取法与索氏提取法提取效率相当，均高于回流提取法。程永杰等[7]采用正交试验法筛选出牛膝中总皂苷的最佳提取工艺为药材10倍量的80%乙醇为溶剂，提取3次，每次1 h。柳立新等[8]比较了甲醇回流提取、乙醇回流提取、乙醚索氏提取除杂再用甲醇回流提取、水超声提取和乙醇超声提取5种方法，发现70%乙醇超声提取和回流提取总皂苷的含量较高，分别为4.97%和4.75%。尚风琴[9]以70%乙醇为提取溶剂，料液比1∶10，比较了超声法、回流法和浸渍法3种提取方法，结果显示最佳提取方式顺序为回流提取>浸渍提取>超声提取，进一步正交试验考察了乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间4个因素，最优提取工艺为采用90%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶12，提取3次，每次1 h，川牛膝总皂苷含量达10.97 mg/g。目前针对川牛膝皂苷类化合物提取分离研究较少，通过上述文献研究可知，川牛膝皂苷类化合物提取分离可采用乙醇回流提取法，通过有机溶剂萃取去除脂溶性成分，然后经大孔树脂进行分离纯化，该方案简单易行，且易于工业化。

1.2 含量测定方法

三萜皂苷类化合物含量检测主要为紫外分光光度法和液相色谱法。卫修来等[10]利用三萜总皂苷可与高氯酸-香草醛试剂显色的原理，建立了紫外分光光度法测量牛膝总皂苷，以齐墩果酸为对照品，最大吸收波长为544 nm，该方法测得怀牛膝中总皂苷平均含量为6.24%;利用同一比色法方法，最大吸收波长为547 nm，柳立新等[8]测得土牛膝中总皂苷含量最高为4.97%。王丽景[5]选取最大吸收波长为527 nm，测定牛膝提取纯化后总皂苷含量为60%，由于比色法所用的显色剂专属性较差，可能是造成最大吸收波长差异较大的原因。

欧丽兰等[11-12]采用高效液相色谱法（HPLC）测定土牛膝中齐墩果酸含量、比较怀牛膝与川牛膝中皂苷含量的不同。尚风琴[9]建立了川牛膝总皂苷的HPLC-MS指纹图谱，测得大孔树脂富集后的川牛膝皂苷总提取物含量为52.5%。闫文静等[13]采用HPLC-ELSD法较好地分离了两种皂苷，并测定其含量。

2 甾酮

2.1 提取分离方法

川牛膝中甾酮类化合物多达13种，主要为杯苋甾酮及其类似物，是川牛膝发挥药理作用的重要化学成分。2020版《中国药典》规定，川牛膝中杯苋甾酮含量不得少于0.03%。王龙等[14]采用正交试验法考察了水量、提取温度、提取时间和次数3个因素对牛膝中甾酮的提取效率影响，最优工艺为料液比1∶50，温度50～100 ℃，提取2次，每次2 h，水煮提取物中蜕皮甾酮含量为9.30%。同时，还以水为溶剂提取牛膝总甾酮[15]，分别按料液比1∶20、1∶15水煎煮2次，每次2 h，提取液经D型大孔树脂处理，考察pH、吸附流速、洗脱液种类及用量对牛膝总甾酮的影响，在最优分离条件下，D型大孔树脂对牛膝甾酮的吸附量为28.9 mg/g，纯化后的牛膝总甾酮含量达60%，蜕皮甾酮含量达10%。孟大利等[16-17]以乙醇为提取溶剂，采用回流提取法，经大孔树脂脱糖纯化、系统溶剂萃取、硅胶色谱柱层析分离，得到漏芦甾酮B、旌节花甾酮D和红苋甾酮;林大专等[18]采用类似提取分离方法得到3种蜕皮甾酮。蒙汉富等[19]以甲醇或水为提取溶剂，采用正交试验法考察了甲醇浓度、提取时间、提取次数、溶剂倍量4种因素，最佳提取工艺为60倍量30%甲醇超声提取2次，每次1.5 h。孔飞飞等[20]采用回流提取法考察了乙醇浓度、溶剂倍量及提取时间3个因素对杯苋甾酮的提取效率影响，最优提取工艺为用70%乙醇加热回流提取2次，料液比分别为1∶12和1∶10，提取时间均为2 h。孙亮亮等[21]采用响应面分析法优化了超声法提取甾酮，以正丁醇水溶液为提取溶剂，考察了溶剂、料液比及提取时间对β-蜕皮甾酮提取效率的影响，最优工艺为45%正丁醇溶液，料液比为1∶15，提取时间1.7 h。欧阳文等[22]采用甲醇回流提取3次，每次2 h，提取液浓缩后经制备型ODS层析柱、硅胶柱层析分离得β-蜕皮箔酮、牛膝甾酮、水龙骨甾酮3种单体化合物。朱婷婷等[23]采用乙醇渗漉提取，浓缩液经系统溶剂萃取、柱层析分离得25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮和β-牛膝甾酮单体化合物。

除了上述常规溶剂提取法外，郑义哲[24]采用二氧化碳超临界流体萃取法提取蜕皮甾酮，首先探索夹带剂对提取蜕皮甾酮的影响，确定最优工艺条件是以二甲亚砜为夹带剂，压力25 MPa、温度70 ℃，夹带剂流速0.5 mL/min，静态萃取时间10 min，动态萃取时间1 h，二氧化碳流量2 L/min。

综上可知，鉴于试验条件及制备量的因素，川牛膝中甾酮类化合物可采用有机溶剂提取法，大孔树脂分离纯化，再结合有机溶剂（乙酸乙酯、正丁醇）萃取法可得到含量较高的甾酮类化合物，如分离单体化合物须经多次层析分离等方法来实现。

2.2 含量测定方法

甾酮类与三萜皂苷具有相似的结构母核，可以采用香草醛-高氯酸比色法测量甾酮含量。王龙等[25]利用该方法，以β-蜕皮甾酮为对照，在最大吸收峰550 nm处，紫外分光光度法测得大孔树脂富集后的牛膝提取物总甾酮含量为53.3%。刘姣等[26]以同样的方法，采用最大吸收波长243 nm，测定怀牛膝中总甾酮含量为2.089%。

显色法专属性较差，目前甾酮类化合物含量检测主要为高效液相色谱法。 胡亮等[27-28]采用反向色譜柱测定粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝、杯苋甾酮含量。尚风琴[9]利用HPLC-MS法构建怀牛膝和川牛膝总甾酮指纹图谱。川牛膝中甾酮类化合物主要为杯苋甾酮、羟基杯苋甾酮、森告甾酮等，2020版中国药典规定了川牛膝中杯苋甾酮的检测方法，采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，检测波长为243 nm。

综上可知，可利用HPLC法测定川牛膝甾酮类单体化合物的含量，该方法简单，结果可靠。

3 多糖

3.1 提取分离方法

最新研究表明，川牛膝多糖类成分具有很好药理活性。刘颖华等[29]采用水提醇沉法得川牛膝多糖粗品，经阴离子交换树脂和凝胶分离，得多糖纯品，总收率为22.5%。赵磊等[30]以热水为提取溶剂，经氯仿萃取，浓缩后醇沉得到川牛膝粗多糖，考察提取时间、料液比、温度、提取次数4种因素对多川牛膝粗多糖提取效率的影响，最优工艺参数为料液比1∶15，提取温度60 ℃，浸提时间2 h，提取1次，醇沉浓度85%，川牛膝多糖的收率为49.18%。侯剑萍等[31]采用水煎煮法提取粗多糖，经脱蛋白、脱盐和醇沉法纯化，最佳提取纯化工艺为料液比1∶10，提取3次，每次2 h，采用三氯乙酸（TCA）法脱蛋白，分子筛法脱盐处理，80%乙醇沉淀。梁歌等[32]采同样的水提醇沉法提取川牛膝粗多糖，通过正交试验考察了提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度对多糖得率的影响，最佳提取工艺为提取温度100 ℃，提取时间8 h，料液比1∶20，95%乙醇溶液。黄志芳等[33]采用75%乙醇回流提取，经水提取、浓缩、醇沉，收集沉淀，再用三氯乙酸除去蛋白、醇沉、有机溶剂洗涤等步骤得到牛膝多糖，收率为7.2%，含量达12.85%。

刘传敏等[34]采用酶解超声法提取川牛膝多糖，正交试验考察了酶解时间、酶用量、pH、酶解温度对酶解效果的影响和样品粒度、料液比、超声时间、超声次数对提取效果的影响。最佳工艺条件为酶解1 h，酶用量15 U/g，pH 5.0，酶解温度50 ℃，粒度20目，料液比1∶40，超声时间20 min。谷旭晗等[35]采用同样的酶法提取川牛膝多糖，通过正交试验确定最佳工艺条件为药材粒径550～830 μm、酶用量4 mg/g、酶解温度50 ℃、酶解时间90 min、溶剂pH为5.0、料液比1∶60，提取时间30 min，在此条件下，川牛膝多糖收率为71.7%。叶秀娟等[36]以复合酶解法进行提取，最佳提取工艺为料液比1∶20、复合酶用量0.7%、pH 6.0、温度45 ℃，该条件下提取的川牛膝多糖含量大于52%。

魏涛等[37]利用超声波辅助提取怀牛膝多糖，经石油醚和乙醇脱脂除杂，水为溶剂，正交试验确定最优提取条件为超声功率1 000 W、提取温度60 ℃、提取时问60 min、料液比1∶30，怀牛膝多糖提取率为6.1%。姜艳等[38]采用同样方法提取牛膝多糖，最后经醇沉得到牛膝多糖，收率达到11.7%。赵玥琪等[39]以川牛膝为原料，比较了超声辅助提取法与煎煮法提取多糖的效率，发现在相同的提取温度、时间和料液比情况下，超声波提取法比煎煮提取效率高9.8%。

除了上述超声波提取法，微波辅助法也应用于牛膝多糖的提取分离研究中[40-41]。此外，蒸汽爆破预处理法有助于牛膝多糖的提取[42]。多糖纯化工艺中，采用醇沉、萃取法除蛋白等方法较多，壳聚糖为絮凝剂有助于川牛膝的总多糖絮凝纯化[43]。

3.2 含量测定方法

多糖测定方法主要为苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法比色法。丁淑彬等[44-45]采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸显色法，在490 nm波长处对川牛膝中多糖的含量进行了测定，该法简单快速、灵敏度高、重现性好。张纯等[46]改良了蒽酮-硫酸比色法测牛膝多糖，经典的蒽酮-六十显色法反应条件为蒽酮试剂浓度为0.2%，反应温度100 ℃，反应时间10 min，波长620 nm，发现反应温度会改变最大吸收波长，优化后的反应条件更改为反应温度20 ℃，其他条件不变。李根林等[47]比较了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法2种方法对多糖含量检测的影响，发现苯酚-硫酸法显色灵敏度高于蒽酮-硫酸显色法。

除了上述比色法测量多糖外，多糖经水解为单糖后可利用高效液相色谱法进行测定，王小燕等[48]利用牛膝多糖的柱前衍生化，建立怀牛膝多糖的柱前衍生化-HPLC指纹图谱及单糖含量测定方法，可为怀牛膝饮片质量评价提供参考。

4 小结

该研究主要对川牛膝和怀牛膝中三萜皂苷类、甾酮类及多糖3种主要成分的提取分离与含量测定进行综述，发现研究主要集中在化学成分和药理学研究，对3种主要成分的批量纯化工艺研究较少，对单体化合物的检测方法研究还不足。川牛膝做为川产道地药材，未来可进一步针对有效成分的分离及纯化进行深入研究，为进一步开发川牛膝的应用提供有力支撑。

安徽农业科学2022年

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