RASSF1A在乳腺癌中表达及临床意义

杜旺，汤铜，钱波，李佳，郑璐，童婷婷

(安徽医科大学第二附属医院普外科，安徽 合肥 230601)

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一，也是女性癌症死亡的首要原因。全球癌症数据显示,2012年新发乳腺癌病例约170万，死亡病例约52万，新增病例和死亡病例分别占据全球女性癌症的25%和15%[1]。在中国情况同样严重，2016年全国肿瘤登记中心最新发布数据显示，乳腺癌发病率和病死率分别占女性恶性肿瘤第1位和第6位[2]。乳腺癌病因相当复杂，与遗传因素、激素、免疫及各种环境因素有关。随着人们对乳腺癌发病相关基因和分子机制认识的加深，许多引起细胞增殖或抑制凋亡的分子已经成为肿瘤治疗的新靶点[3]，其中有些可能成为推测乳腺癌患者预后的候选标志物[4]。自被发现以来，RASSF1A基因已经被广泛研究。多项研究表明，RASSF1A几乎在全身正常组织器官中均表达，而在多种实体肿瘤中存在表达缺失[5]。本文旨在研究RASSF1A在乳腺癌以及癌旁组织中的表达情况，并分析其临床意义，探讨其在乳腺癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床标本 收集安徽医科大学第二附属医院普外科2015年3月—2016年3月经病理确诊的60例乳腺癌患者的癌组织及相应癌旁组织。其中女性59例，男性1例，年龄34～74岁，中位年龄48岁。所有患者术前均未进行新辅助化疗或放疗。标本离体后即用福尔马林浸泡固定备用。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 临床和病理资料 根据所取标本对应住院号，在患者病历档案中提取所需各项临床、病理及影像资料，包括患者性别、年龄、肿瘤最大直径、淋巴结转移情况、肿瘤组织学分级、脉管侵犯情况、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(HER-2)、Ki-67 、TMN分期等资料。

1.3 试剂材料 RASSF1A单克隆抗体(Cat# ab23950 Abcam)购自Abcam公司；免疫组化检测试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司；石蜡切片制作所需材料试剂由安徽医科大学病理教研室提供。

1.4 制作石蜡切片、免疫组化染色及判定 将“1.1”项目中所固定好的标本经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片制成石蜡切片。按照试剂说明书进行染色步骤，并应用已知阳性切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

RASSF1A蛋白定位于胞质内，以棕色、棕褐色、黄色颗粒为阳性表达。结果判定标准，选取不重复的5个视野，按染色强度及阳性细胞所占的百分比综合计分。染色强度：无色计为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数：小于等于总数的10%计为1分；在>10%～50%之间计为2分；>50%计为3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相乘，1 分计为阴性“-”；2～4 分计阳性“+”；≥ 6分计为强阳性“+++”。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行处理分析，数据采用χ2检验、Fisher确切概率法等进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RASSF1A在乳腺癌及癌旁组织表达情况 RASSF1A蛋白定位于细胞质内，以棕色、黄色、棕褐色颗粒沉淀为阳性表达(见图1)。经观察分析，在60例乳腺癌组织中，有21例呈阳性表达，而在60例癌旁组织中52例呈阳性表达。RASSF1A 蛋白在癌旁组织表达阳性率高于癌组织(P<0.05)。

2.2 RASSF1A在乳腺癌组织中表达与相关临床病理资料相关性分析 所收集60例乳腺癌临床标本中，有21例RASSF1A表达阳性。经分析，RASSF1A蛋白的表达情况与性别、年龄、肿瘤最大直径、ER、PR状态无相关性(P>0.05),而与有无淋巴结转移、组织学分级、脉管侵犯、HER-2、Ki-67有相关性(P<0.05)。其中无淋巴结转移者RASSF1A表达阳性率为60.0%(12/20)，有淋巴结转移者RASSF1A表达阳性率为22.5%(9/40)；组织学分级Ⅰ级者表达阳性率为72.7%(8/11)，组织学分级Ⅱ级者表达阳性率为35.5%(11/31)，组织学分级Ⅲ级者表达阳性率为11.1%(2/18)；有脉管侵犯者表达阳性率为18.2%(4/22)，无脉管侵犯侵犯者表达阳性率为44.7%(17/38)；HER-2扩增者阳性表达率为16.7%(5/30),HER-2未扩增者阳性表达率为56%(14/25)。Ki-67表达≤14%者阳性表达率为54.17%(13/24),Ki-67表达>14%者阳性表达率为22.2%(8/36)。其中HER-2状态检测首先经安徽医科大学第二附属医院病理科应用免疫组织化学染色方法检测，评分“0”或者“1+”的为HER-2阴性；评分“2+”者为交界性，需要进一步检测；评分“3+”为HER-2阳性。所收集60例临床病例中，HER-2评分为“2+”的患者有5例未选择进一步做FISH检测。相关统计结果见表1。

2.3 RASSF1A在乳腺癌组织中表达与TMN分期相关性分析 经过提取病案资料分析，TMN分期为局部早期(Ⅰ期、Ⅱ期以及部分ⅢA期(T3N1MO))的患者有31例，其中RASSF1A蛋白阳性表达率为48.4%(15/31)。TMN分期为局部晚期[Ⅲ期(除T3N1MO外)、Ⅳ期]的患者有29例，其中RASSF1A蛋白阳性表达率为20.7%(6/29)，乳腺癌局部早期患者中RASSF1A蛋白阳性表达率高于局部晚期患者，差异有统计学意义(χ2=5.053,P=0.025)。

注:A.乳腺癌组织中RASSF1A蛋白表达阴性；B.癌旁组织中RASSF1A蛋白表达阳性；C.乳腺癌组织中RASSF1A蛋白表达阳性；D.癌旁组织中RASSF1A蛋白表达阴性。

图1 免疫组化检测RASSF1A在乳腺癌及癌旁组织表达情况(×200) 表1 60例患者临床病理资料的相关性分析

注：各组织学分级之间采用χ2检验的多重比较。

3 讨论

RASSF1A基因是2000年Dammann等[6]在研究肺癌时通过酵母双杂交筛选法首次发现其位于人类3号染色体短棒2区第1条带第2亚带(3p21.3)上。RASSF1A基因是RASSF中的一员。RASSF包含了10个成员，分别是RASSF1～10[7]。其中RASSF1～6拥有C端Ras相关区域，而RASSF7-10则包含了N端Ras相关区域[8]。其中，RASSF1基因包含8个外显子(1α、1β、2αβ、2γ、3、4、5和6)。通过不同启动子利用和可变剪接，RASSF1基因在人体中可以产生7种转录本(RASSF1A-G)，目前研究最多的是RASSF1A和RASSF1C。RASSF1A由外显子1α、2αβ、3、4、5、6编码，其中外显子3、4、5、6编码Ras相关区域[5，7]。RASSF1A的cDNA全长1873bp，其包含的开放阅读框架(ORF)编码一个分子量为38.8kD含有340个氨基酸的蛋白多肽[6]。RASSF1A蛋白含有多个重要的区域，从N端到C端分别为SH3结合区域、C1/DAG结合域即蛋白激酶C保守区1、ATM激酶磷酸化位点、Ras相关区域和一个SARAH序列[9]。多项研究发现，RASSF1A所包含的几个特定区域可能对其作为抑癌基因具有重要作用[10-13]。

研究发现RASSF1A在多种人体肿瘤中存在表达缺失，而其表达缺失的主要原因是启动子CPG岛甲基化[14-17]。作为一种抑癌基因，其缺失表达与肿瘤的发生、发展密切相关[18]。本研究中，通过对乳腺癌及癌旁组织中RASSF1A表达量的检测发现，乳腺癌组织中的RASSF1A表达阳性率为35%(21/60)，而在癌旁组织中表达阳性率86.7%(52/60)，癌旁组织中RASSF1A 蛋白的表达阳性率明显高于癌组织(P<0.05)，也证实RASSF1A的缺失表达可能参与肿瘤的发生过程。

有关RASSF1A的研究非常广泛，但有关其抑癌具体机制目前尚未完全明确。目前主要观点认为有促进凋亡、调节细胞周期以及促进微管稳定性三种作用机制及途径[9]。Dammann等[6]首次发现RASSF1A时，便指出使肺癌细胞重新表达RASSF1A基因可抑制其集落形成、非锚定生长以及裸鼠成瘤的能力。研究发现，RASSF1A的过表达能够促进细胞凋亡、细胞周期停滞和降低肿瘤细胞的致瘤性[19]。 除了发现RASSF1A 蛋白在癌组织和癌旁组织表达差异有统计学意义，本研究也发现，在乳腺癌组织中RASSF1A表达和有无淋巴结转移、组织学分级、有无脉管侵犯、HER-2状态、Ki-67有相关性(P<0.05)。并且，TMN分期为早期[Ⅰ期、Ⅱ期以及部分ⅢA期(T3N1MO)]的患者RASSF1A蛋白阳性表达率为48.4%(15/31)。TMN分期为晚期[Ⅲ期(除T3N1MO外)、Ⅳ期]RASSF1A蛋白阳性表达率为20.7%(6/29)(P<0.05)。这也是提示着，RASSF1A在乳腺癌的发展过程中可能有重要作用。

综上所述，本研究进一步证实了RASSF1A作为一种候选抑癌基因的可行性。其在乳腺癌组织中低表达，而在癌旁组织高表达。有关临床、病理及影像资料与RASSF1A表达的相关性分析提示，RASSF1A可以作为一种潜在的乳腺癌临床预后判断指标。

[1] TORRE LA,BRAY F,SIEGEL RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2] 陈万青,郑荣寿,张思维,等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析 [J].中国肿瘤,2016,25(1):1-8.

[3] SAAL LH,HOLM K,MAURER M,et al.PIK3CA mutations correlate with hormone receptors,node metastasis,and ERBB2,and are mutually exclusive with PTEN loss in human breast carcinoma[J].Cancer Res,2005,65(7):2554-2559.

[4] 田多,汤铜,钱波,等.叉头盒蛋白A1(FOXA1)在乳腺癌中的表达及其临床意义 [J].安徽医药,2015,19(9):1691-1694.

[5] HESSON LB，COOPER WN，LATIF F.Evaluation of the 3p21.3 tumour-suppressor gene cluster[J].Oncogene，2007，26(52)：7283-7301.

[6] DAMMANN R，LI C，YOON JH，et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3[J].Nat Genet，2000，25(3)：315-319.

[7] RICHTER AM，PFEIFER GP，DAMMANN RH.The RASSF proteins in cancer;from epigenetic silencing to functional characterization[J].Biochim Biophys Acta，2009，1796(2)：114-128.

[8] SHERWOOD V，RECINO A，JEFFRIES A，et al.The N-terminal RASSF family：a new group of Ras-association-domain-containing proteins，with emerging links to cancer formation[J].Biochem J，2009，425(2)：303-311.

[9] GORDON M，BAKSH S.RASSF1A：Not a prototypical Ras effector[J].Small GTPases，2011，2(3)：148-157.

[10] FOLEY CJ，FREEDMAN H，CHOO SL，et al.Dynamics of RASSF1A/MOAP-1 association with death receptors[J].Mol Cell Biol，2008，28(14)：4520-4535.

[11] AVRUCH J，XAVIER R，BARDEESY N，et al.Rassf family of tumor suppressor polypeptides[J].J Biol Chem，2009，284(17)：11001-11005.

[12] HAMILTON G，YEE KS，SCRACE S，et al.ATM regulates a RASSF1A-dependent DNA damage response[J].Curr Biol，2009，19(23)：2020-2025.

[13] THALER S，HHNEL PS，SCHAD A，et al.RASSF1A mediates p21Cip1/Waf1-dependent cell cycle arrest and senescence through modulation of the Raf-MEK-ERK pathway and inhibition of Akt[J].Cancer Res，2009，69(5)：1748-1757.

[14] NILSSON TK，LÖF-ÖHLIN ZM，SUN XF.DNA methylation of the p14ARF，RASSF1A and APC1A genes as an independent prognostic factor in colorectal cancer patients[J].Int J Oncol，2013，42(1)：127-133.

[15] ZHONG S，YEO W，TANG MW，et al.Intensive hypermethylation of the CpG island of Ras association domain family 1A in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinomas[J].Clin Cancer Res，2003，9(9)：3376-3382.

[16] KUROKI T，TRAPASSO F，YENDAMURI S，et al.Promoter hypermethylation of RASSF1A in esophageal squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res，2003，9(4)：1441-1445.

[17] MURRAY PG，QIU GH，FU L，et al.Frequent epigenetic inactivation of the RASSF1A tumor suppressor gene in Hodgkin's lymphoma[J].Oncogene，2004，23(6)：1326-1331.

[18] FERNANDES MS，CARNEIRO F，OLIVEIRA C，et al.Colorectal cancer and RASSF family——a special emphasis on RASSF1A[J].Int J Cancer，2013，132(2)：251-258.

[19] AGATHANGGELOU A，COOPER WN，LATIF F.Role of the Ras-association domain family 1 tumor suppressor gene in human cancers[J].Cancer Res，2005，65(9)：3497-3508.