白细胞介素-35在类风湿关节炎中作用的研究进展

徐文俊,蔡辉

(1.安徽中医药大学研究生院 ，安徽 合肥 230012;2.中国人民解放军南京总医院，江苏 南京 210002 )

类风湿关节炎(RA)是一种以对称性、多关节炎为主要表现的慢性、全身性自身免疫性疾病。目前病因及发病机制尚未完全明确。白细胞介素-35(IL-35)是白细胞介素-12(IL-12)家族细胞因子中目前出现的新成员，其在某些自身免疫疾病方面发挥关键作用[1]，每一个家族成员均有一个α链和一个β链组成，α链(包含p19、p28、p35)，β链(包含p40、 EBI3)，α链包含一个四螺旋束结构，而β链含有一个I类细胞因子受体结构。IL-35由p35和诱导基因3(EBI3)合成，IL-35以p35亚基作为配体，EBI3亚基主要发挥免疫调节作用[2]，因此，IL-35主要发挥调节功能。研究IL-35的生物学功能对RA的治疗具有十分重要的临床意义。

1 IL-35的生物学功能

2007年IL-35被发现。IL-35大部分由调节性T细胞(Treg)分泌[3]，少数可由活化的B细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞分泌[4-7]。IL-35在小鼠和人体内均能诱导产生IL-35的T淋巴细胞(iTr35 cells)的形成[8]。与其他IL-12家族细胞因子的促炎作用不同，IL-35是CD4+CD25+Treg细胞分泌的抑制性细胞因子，它能抑制效应T细胞增殖，同时增加培养液中干扰素γ(INF-γ)浓度而显著的抑制CD+CD25-效应性T淋巴细胞(Teff)的分化。

Treg通过释放白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、IL-35或与CD39、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)表面分子接触诱导Treg产生，Treg根据来源分为天然性调节性T细胞(nTreg)和诱导性T细胞(irTreg)，nTreg以CD4+CD25+Foxp3+为表型，irTreg在IL-10、TGF-β、IL-35的刺激下产生[9-10]。

iTr35细胞只通过IL-35介导免疫抑制，而不是通过其他已知的抑制性细胞因子(如IL-10或者TGF-β)[11-13]。 iTr35细胞是由IL-35和IL-10在体外合成，在体内如实验小鼠模型中感染肠道蠕虫鼠鞭虫的肠道局部或者在肠道肿瘤组织内合成。因此，iTr35是炎症或者肿瘤耐受的重要调节点[3,8,14]。

每个IL-12家族成员的信号都有一个不同的受体。IL-12受体和IL-23受体都有一共同的IL-12Rβ1亚基，但IL-12有IL-12Rβ2亚基，IL-23有IL-23R亚基，IL-27有gp130和WSX-1(IL-27R)亚基，IL-35受体与IL-27受体都有一相同的gp130亚基，以及与IL-12受体都有一个相同的IL-12Rβ2亚基，IL-35借助同源二聚体gp130和IL-12Rβ2能够参与信号转导[15]，IL-12Rβ2受体的表达除了发现Treg细胞外，还发现其他细胞(包括B细胞和树突状细胞(DC)，在免疫系统方面这也许会影响IL-35的生物学功能[16]，gp130在大多数细胞中都有表达，IL-12Rβ2主要表达于激活的T细胞和自然杀伤细胞(NK)[17]，但不表达于静止的T细胞[18]。研究发现[19]，IL-12Rβ2缺陷的小鼠更易患自身免疫病和B细胞介导的恶性肿瘤。

来源于EBI3 或 p35基因缺失小鼠的Treg在体内外实验中的调节活性明显降低，也提示IL-35为Treg细胞发挥正常功能所必需的[3]。P35或EBI3基因缺失的小鼠不会发生自身免疫性疾病和炎症性疾病[20]，此类小鼠体内Treg的比例以及Foxp3基因的表达水平与野生小鼠相同。无论T细胞如何增殖，EBI3-/-和 IL-12α-/-Treg的免疫抑制能力与野生小鼠相比显著降低。

IL-35的信号转导主要通过IL-35与其细胞受体相互作用诱导的酪氨酸蛋白激酶(JAK)家族蛋白依赖的磷酸化作用，JAK家族(JAKs)活化后激活信号传导及转录激活因子(STATs)(如STAT1和 STAT4)，STAT与其受体结合并在JAK激酶的作用下实现其磷酸化，两个磷酸化的STAT分子形成同异二聚体并离开受体进入细胞核，在核内他们与靶基因的启动子中特异的DNA序列结合，从而调节细胞因子特异的基因表达和相应的生物学效应[21]。

IL-35通过p35和EBI3亚基分别与相应受体的不同部位结合，利用转录因子STAT1和STAT4传递转录信号。IL-35主要由Treg细胞分泌，它可以有效抑制效应T细胞增殖、Th17分化和IL-17的分泌[4,16]。iIL-35能够诱导Treg细胞表达共抑制分子CTLA-4与抗原提呈细胞(APCs)表面标记分子CD80和CD86高亲和力结合而启动抑制信号，T细胞接受抗原刺激后，经过增殖、分化，形成效应T细胞[22]。体液免疫也一直被认为是通过重组白细胞介素-35 (rIL-35)作用来发挥抑制，通过人B细胞转化为调节性B细胞，产生IL-35以及IL-10[6]。

2 IL-35在治疗RA中的临床应用前景

IL-35可被应用于以下自身免疫系统疾病：RA、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬皮病(SSC)等[23]。IL-35是一群来源于Treg的抑制性细胞因子，具有促进Treg的分化和增殖，发挥免疫调节的功能。在这项研究中，我们主要目的是确定IL-35能有效地抑制胶原诱导型关节炎(CIA)的发展及关节进行性破坏[24]。在CIA中：IL-35能抑制核因子-κB受体，通过活化因子配体(RANKL)的表达，促进氧基聚明胶(OPG)的表达，这进一步说明IL-35可用于治疗RA[25]。

Hou等[26]为了探讨IL-35对IL-10、 TGF-β、INF-γ、IL-12 和 IL-17的潜在影响，将一个含 pcDNA3.1的IL-35的质粒注射到BALB/c小鼠的玻璃体腔内使IL-35过表达，发现IL-10和TGF-β的表达升高，分别在注射后1周和2周达到最高水平。此外，在注射IL-35表达质粒后2周，INF-γ和IL-12的表达明显降低，且在注射IL-35表达质粒后4周明显抑制IL-17的表达。因此，IL-35的质粒注射至小鼠的玻璃体内，会下调促炎细胞因子的表达，并上调抗炎细胞因子的表达。Houshmandi等[27]的研究发现：一些细胞因子介导的促生长因子-1(IGF-1)的作用是针对炎症方面的，而且IGF-1和血管内皮功能失调之间相关联。在慢性关节炎症和滑膜血流量方面，这些细胞因子和他们的IGF-1介导作用的效应已经被研究[27]。

IL-35特异性表达和它的调节功能将会在慢性炎症方面成为潜在的治疗靶点，同时与IL-12其他家族成员的受体共享相同的亚基，这对于IL-35特异性试剂发展存在潜在障碍。然而，它与RA骨破坏的发生有直接关系。Tregs表达IL-35，因此通过恢复Treg细胞抑制能力和抑制Th17通路来发挥抗炎作用[28]。IL-35通过抑制Th17等效应分子发挥免疫调节作用，参与自身免疫系统疾病(如胶原诱导的关节炎)[29]。研究发现：构建的EBI3-p35-Fc融合蛋白在体外能促进CD4+CD25+Treg增殖，抑制CD4+CD25-Treg增殖，体内外均可以抑制Th17分化，减少IL-17的分泌，增强IFN-γ分泌，从而达到减轻CIA症状的效果[30]。在自身免疫系统疾病发病机制方面IL-35能发挥关键作用。Ning等[31]对参加实验的100例RA患者和50例健康受试人群血清中IL-35的检测水平进行一系列比较发现：(1)RA患者较健康受试人群水平低；(2)侵蚀性关节炎RA组较无侵蚀性关节炎RA组患者的水平低；(3)RA患者抗环瓜氨酸肽(CCP)阳性组与阴性组之间差异无统计学意义；(4)IL-35与RA患者年龄、类风湿因子(RF)和嗜酸性粒细胞百分比之间存在显著的负相关。结果显示，在RA患者的发病机制中IL-35发挥保护性作用。

3 展望

综上所述，IL-35通过诱导Treg细胞增殖和抑制Th17分泌IL-17以及抑制Teff增殖发挥免疫抑制作用。IL-35作为炎症抑制性细胞因子，有望成为RA治疗的新靶点。但IL-35具体受体、信号转导机制及对非T细胞的影响尚未明确，成为目前最需解决的问题，进一步阐明RA发病机制以及探讨应用于临床的IL-35免疫抑制剂将十分必要。

[1] LIU N,ZHANG S,LI C,et al.THU0273 Decreased interleukin-35 is associated with higher risk of pregnancy morbidity in patients with antiphospholipid syndrome[J].Annals of the Rheumatic Diseases,2016,75(2):286.

[2] LIU N,ZHANG S,LI C,et al.Elevated level of interleukin-35 in colorectal cancer induces conversion of T cells into iTr35 by activating STAT1/STAT3[J].Oncotarget,2016,7(45):73003-73015.

[3] COLLISON LW,WORKMAN CJ,KUO TT,et al.The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function[J].Nature，2007,450(7169):566-569.

[4] TEDDER TF,LEONARD WJ.Autoimmunity:regulatory B cells —IL-35 and IL-21 regulate the regulators[J].Nat Rev Rheumatol,2014,10(8):452-453.

[5] BANCHEREAU J,PASCUAL V,O′GARRA A.From IL-2 to IL-37:the expanding spectrum of anti-inflammatory cytokines[J].Nat Immunol,2012,13(10):925-931.

[6] SHEN P,ROCH T,LAMPROPOULOU V,et al.IL-35-producing B cells are critical regulators of immunity during autoimmune and infectious diseases[J].Nature,2014,507(7492):366-370.

[7] TERAYAMA H,YOSHIMOTO T,HIRAI S,et al.Contribution of IL-12/IL-35 common subunit p35 to maintaining the testicular immune privilege[J].PLoS One,2014,9(4):e96120.

[8] COLLISON LW,CHATURVEDI V,HENDERSON AL,et al. IL-35-mediated induction of a potent regulatory T cell population[J].Nat Immunol,2010,11(12):1093-1101.

[9] PANKRATZ S,BITTNER S,HERRMANN AM,et al.Human CD4+ HLA-G+ regulatory T cells are potent suppressors of graft-versus-host disease in vivo[J].FASEB J,2014,28(8):3435-3445.

[10] ZHENG SG,GRAY JD,OHTSUKA K,et al.Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors[J].J Immunol,2002,169(8):4183-4189.

[11] CUA DJ,SHERLOCK J,CHEN Y,et al.Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain[J].Nature,2003,421(6924):744-748.

[12] MURPHY CA,LANGRISH CL,CHEN Y,et al.Divergent pro- and antiinflammatory roles for IL-23 and IL-12 in joint autoimmune inflammation[J].J Exp Med,2003,198(12):1951-1957.

[13] LANGRISH CL,CHEN Y,BLUMENSCHEIN WM,et al.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[J].J Exp Med,2005,201(2):233-240.

[14] JONULEIT H,SCHMITT E,KAKIRMAN H,et al.Infectious tolerance:human CD25(+) regulatory T cells convey suppressor activity to conventional CD4(+) T helper cells[J].J Exp Med,2002,196(2):255-260.

[15] COLLISON LW,DELGOFFE GM,GUY CS,et al.The composition and signaling of the IL-35 receptor are unconventional[J].Nat Immunol,2012,13(3):290-299.

[16] WANG RX,YU CR,DAMBUZA IM,et al.Interleukin-35 induces regulatory B cells that suppress autoimmune disease[J].Nat Med,2014,20(6):633-641.

[17] WU CY,GADINA M,WANG K,et al.Cytokine regulation of IL-12 receptor beta2 expression:differential effects on human T and NK cells[J].Eur J Immunol,2000,30(5):1364-1674.

[18] KOCH MA,THOMAS KR,PERDUE NR,et al.T-bet(+) Treg cells undergo abortive Th1 cell differentiation due to impaired expression of IL-12 receptor β2 [J].Immunity,2012,37(3):501-510.

[19] AIROLDI I,DI CARLO E,COCCO C,et al.Lack of Il12rb2 signaling predisposes to spontaneous autoimmunity and malignancy[J].Blood,2005,106(12):3846-3853.

[20] NIEUWENHUIS EE,NEURATH MF,CORAZZA N,et al.Disruption of T helper 2-immune responses in Epstein-Barr virus-induced gene 3-deficient mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(26):16951-16956.

[21] COSKUN M,SALEM M,PEDERSEN J,et al.Involvement of JAK/STAT signaling in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J].Pharmacol Res,2013,76:1-8.

[22] OLSON BM,JANKOWSKA-GAN E,BECKER JT,et al.Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade[J].J Immunol，2012,189(12):5590-5601.

[23] GUAN SY,LENG RX,KHAN MI,et al.Interleukin-35:a potential therapeutic agent for autoimmune diseases[J].Inflammation,2017,40(1):303-310.

[24] ALVAREZ S,BISCHOFF L,KEENE M,et al.Modulation of autoimmunity and allograft rejection by viral expression of interleukin-35[J].Canadian Journal of Diabetes,2016,40(5):S12.

[25] LI Y，LI D,LI Y,et al.Interleukin-35 upregulates OPG and inhibits RANKL in mice with collagen-induced arthritis and fibroblast-like synoviocytes[J].Osteoporosis Int,2016,27(4):1537-1546.

[26] HOU C,WU Q,OUYANG C,et al.Effects of an intravitreal injection of interleukin-35-expressing plasmid on pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines[J].Int J Mol Med,2016,38(3):713-720.

[27] HOUSHMANDI N,NAJAFIPOUR H,JOUKAR S,et al.The effect of interleukins 27 and 35 and their role on mediating the action of insulin Like Growth Factor -1 on the inflammation and blood flow of chronically inflamed rat knee joint[J].Cytokine,2016,81:117-126.

[28] CLAVEL G，THIOLAT A,BOISSIER MC.Interleukin newcomers creating new numbers in rheumatology:IL-34 to IL-38[J].Joint Bone Spine,2013,80(5):449-453.

[29] ZHANG J,LIN Y,LI C,et al.IL-35 decelerates the inflammatory process by regulating inflammatory cytokine secretion and M1/M2 macrophage ratio in psoriasis[J].J Immunol，2016,197(6):2131-2144.

[30] 刘芬，文丽君，刘海燕.IL-35研究进展[J].免疫学杂志，2011,27(7):630-632.

[31] NING X,JIAN Z,WANG W.Low serum levels of interleukin 35 in patients with rheumatoid arthritis[J].Tohoku J Exp Med,2015,237(2):77-82.