腺癌患者和肺移植供者下呼吸道菌群对比研究

张鑫 熊叶 马可 李强,3

近年来通过新一代测序技术分析，人们发现机体拥有非常多样化的微生物群落，而这些微生物群落被认为对人体健康至关重要。已有证据显示人体不同部位微生物菌群的改变与癌症的发生发展相关[1-4]。但到目前为止关于肺部菌群与肺癌之间关系的研究相对较少，是否会像其它部位的菌群一样，变化的肺部菌群影响着肺癌的发生发展目前仍不明确。本研究旨在观察对比腺癌患者下呼吸道和健康肺下呼吸道菌群结构是否存在差异。

对象与方法

一、一般资料

收集12例在上海长海医院胸外科行肺叶切除术的肺腺癌患者作为疾病组(DT组)。12例患者术前经血清学及影像学检查除外合并肺炎，其中男性6例，女性6例，年龄51～73岁(平均64.3岁)。12例患者术后经病理证实均诊断为肺腺癌，临床分期Ⅰb期1例，Ⅱa期6例，Ⅱb期3例，Ⅲa期2例。同时收集5例在无锡市人民医院手术室行双肺移植手术过程中修剪下来的健康肺气管组织作为健康对照组(H组)，5例患者均为男性，年龄34～50岁(平均40.5岁)，影像学检查无明显感染病灶。所有样本在收集前由本人或家属签署知情同意书。

二、呼吸道组织收集及处理

手术室内获取组织后，放入2 ml的无菌Eppendorf管，并做好标记，立即放入液氮中瓶中，之后转运至我科实验室-80°下冻存。干冰下运送至派森诺医药科技有限公司，无菌技术下对组织进行研磨、均浆、DNA提取。

三、测序与分析

本研究采用前引物(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和后引物(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)，对样本DNA进行PCR扩增，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，利用Iliumina MiSeq测序平台对对细菌的16S rDNA基因V4区进行高通量测序。对原始下机数据根据序列质量进行初步筛查，并去除嵌合体等疑问序列。应用UCLUST序列比对工具[5]，对获得的高质量序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分。通过QIIME软件将OTU代表序列与Greengenes数据库[6]的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息。之后对每个样本α多样性指标(Chao1、ACE、Simpson及Shannon指数)进行计算，同时计算各样本在门及属水平上的OTU数。使用Mothur软件，调用Metastats对门和属水平的各个分类单元在样本(组)之间的序列量(即绝对丰度)差异进行两两比较检验。通过Galaxy在线分析平台提交属水平的相对丰度矩阵进行LEfSe分析。使用PICRUSt软件，根据KEGG数据库中微生物代谢功能的类别对群落样本进行预测。

四、统计学方法

采用SPSS22.0统计软件，对符合正态分布的两组数据应用t检验；对不符合正态分布的数据，则进行非参数秩和检验。

结 果

一、样本菌群群落概况

17例组织样本中产生了总共623,370个高质量序列，平均每个样本有36,668个序列。对前述获得的高质量序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，通过去除一些丰度和出现频率都非常低的“稀有”OUT(当于菌群数据中的“背景噪音”)后，共计产生38,220个OUT，平均每个样本具有2,248个OUT。23个高丰度(大于1%)的OTUs占所有序列的80%，大多数剩余的OTUs以低丰度存在(<1%)。根据样本OUT划分和各分类水平微生物类群数统计后发现，两组患者下呼吸道组织标本中4个最丰富的菌门包括：Proteobacteria(65%)，Firmicutes(18%)，Bacteroidetes(9%)和Acidobacteria(2%)，共占了总序列的94%；最丰富的属主要包括：Burkholderia(20%)、Sediminibacterium(7.4%)、Lactobacillus(6%)、Acinetobacter(3.8%)、Pseudomonas(3.7%)、Lactococcus(3.3%)、Caulobacter(3%)、Ralstonia(2.7%)共占了总序列的50%，见图1。

图1 DT组与H组在菌门(左图)及菌属水平(右图)相对丰度情况

二、两组菌群多样性及主要菌群丰度比较结果

两组α多样性指数：Chao1，ACE，Shannon和Simpson如表1所示。从反映菌群丰度的Chao1和ACE指数来看，H组明显高于DT组(P<0.01)。Shannon和Simpson指数反应了菌群的多样性，H组Shannon指数高于DT组(P<0.05)，Simpson指数H和DT组间并没有发现明显区别。Shannon指数对群落的丰富度以及稀有OTU更敏感，而Simpson指数对均匀度和群落中的优势OTU更敏感。以上结果说明，与DT组相比H组菌群丰度、多样性更高。

表1 两组多样性指数比较

注：aP=0.003，bP=0.006，cP=0.043

对两组样本菌群最丰富4个菌门的相对丰度进行比较后发现(图1及表2)，Proteobacteria和Firmicutes在H组丰度明显高于DT组(P<0.01)，Bacteroidetes和Acidobacteria在DT组丰度明显高于H组(P<0.01)。对差异菌门中的菌属进行进一步分析，通过LEfSe分析计算出两组丰度差异值最大的菌属，见图2。发现Vibrio、Bifidobacterium、Megamonas、Streptomyces、Collinsella、Achromobacter等菌属在DT组丰度明显高于H组，Lactobacillus、Erysipelotrichaceae、Oscillospira、Caulobacter、Flavobacterium、Thermoactinomyces、Ruminococcus、Coprobacillus、Dorea等菌属在H组丰度明显高于DT组。

图2 两组间具有显著差异的分类单元(横坐标则以条形图展示对应分类单元的LDA差异分析对数得分值，长度越长表明该分类单元的差异越显著)

表2 两组主要菌门间相对丰度比较

注：aP=0.013，bP=0.0001,cP=0.028,dP=0.0001

三、两组在菌群代谢功能通路上的差异。

通过将现有的群落组成数据与已知的参考基因组数据库相比较，并对原始数据中的微生物丰度数据进行校正，通过PICRUSt软件，根据KEGG数据库中微生物代谢功能的类别对群落样本进行预测。由图3可以预测，外来物质降解与代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢、其他氨基酸的代谢、脂质代谢及氨基酸代谢等代谢功能在H组要高于DT组， 辅助因子与维生素代谢，聚糖生物合成与代谢，酶家族，能量代谢，碳水化合物代谢等代谢功能在DT组要高于H组。

图3 群落样本的代谢功能预测图(图形的长度反映了该样本中编码相应功能的基因丰度的高低)

讨 论

过去一直认为健康肺是无菌的，但随着技术的发展，越来越多的研究显示，肺部存在微生物群落，并且这些微生物群落与多种肺部疾病相关(哮喘、COPD、间质性肺炎、支气管扩张等)[7-10]。在做肺部菌群研究时，许多实验样本都是通过BAL和防污染毛刷获取的，支气管镜通过上呼吸道进入下呼吸道，存在上呼吸道污染下呼吸道样本的风险，但也有研究显示经气管镜(经鼻或经口)取得的BAL中的菌群却未受影响[11]。痰液作为一种无创的并且易获取的标本已经被广泛应用于许多肺部疾病中(如：COPD、哮喘、支气管扩张)[12-15]， 但痰液标本更容易被污染。在手术室通过无菌手术获取肺组织可以避免样本经过上呼吸道，是目前来说最能客观反映肺部菌群的理想样本，因此为了能客观反映腺癌患者下呼吸道菌群结构特点，我们采用了收集手术室肺切除组织作为研究对象。

目前关于非疾病部位肺组织的主要菌门报道相似，主要是以Proteobacteria，Firmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria四大菌门为主。我们的研究也显示肺组织中丰度最高的4个菌门是Proteobacteria(65%)，Firmicutes(18%)，Bacteroidetes(9%)和Acidobacteria(2%)。但关于菌属的相关报道差异较大，Yu等[16]采用illumina测序方法，分析了165例肿瘤患者非肿瘤肺组织样本，发现相对丰度较高核心菌属：Acinebobacter(11.9%)，Comamonadaceae(11.6%)，Thermus(8.7%)，Pseudomonas(7.1%)，Oxalobacteraceae(5.5%)，Ralsonia(2.1%)，Staphylococcus(2.1%)，Streptococcus(2.0%)。而本研究显示除了Acinebobacter、Ralsonia、Streptococcus三种菌属丰度相似外，另外三种Burkholderia、Sediminibacterium、Lactobacillus菌属丰度均较高，Comamonadaceae，Thermus及Oxalobacteraceae菌属丰度较低。Bassis等[11]收集了28例健康人群的BALF，通过454焦磷酸测序的方法分析菌群结构，发现健康人群BALF核心菌属主要是：Prevetella、Streptococcus、Neisseria、Fusobacterium、Veillonella、Porphyromonas、Lactobacillus、Halomonas、Capnocytophaga、Actinomyces等。目前关于肺部菌群的研究大部分集中在西方人，而中国人肺部菌群研究相对较少。Hosgood等[17]收集了8例健康中国女性痰液样本，通过454焦磷酸测序后分析，痰液中核心菌属主要是：Streptococcus、Neisseria、Gemella、Granulicatella、Actinomyces、Veillonella、Prevotella等。可见非疾病部位肺组织在不同的研究中菌属差异较大，考虑可能是受人群，生活区域，取材部位，样本类型，16SrDNA靶测序区，数据库和数据分析方法等影响。目前已有研究显示非疾病部位菌群α多样性与人口密度，空气PM10颗粒物及家用煤燃烧相关[16-17]。

我们选取了12例肺叶支气管开口处作为DT组，5例肺移植者健康肺气管组织作为H组。早期有报道显示非癌组织α多样性要显著高于癌组织，腺癌组织癌组织α多样性要显著高于鳞癌组织[16]。我们的研究显示健康肺呼吸道内菌群α多样性要显著高于腺癌患者呼吸道组织，并且在主要的菌门及菌属丰度两组间差异明显。根据预测两组在菌群代谢通路上亦有诸多不同，这些改变会不会像肠道菌群一样，在癌症的发生、发展过程中起一定作用亦或是由于肺癌的进展导致局部微环境的变化进而影响肺部菌群，目前来看肺部菌群亦有这样的趋势，但还需要更多的研究来探讨这一问题。

本研究的不足是病例数较少，在未来我们需要更大样本的研究来分析中国人在肺内不同位置的菌群结构特征，另外其它的病理类型如鳞癌组织局部的菌群结构特征是否又有所不同，本研究并未涉及。

本研究应用高通量测序的方法，通过在无菌条件下收集样本，分析了我国腺癌患者及健康肺下呼吸道内细菌菌群结构特征，以Proteobacteria(65%)、Bacteroidetes(18%)、Firmicutes(9%)和Acidobacteria(2%)菌门为主。另外本研究发现健康肺呼吸道内菌群α多样性要显著高于腺癌患者呼吸道组织，并且在主要的菌门及菌属丰度两组间差异明显。通过软件预测两组在菌群代谢通路上亦有诸多不同。这些菌群结构的改变对肺腺癌到底有何影响，还需要我们进一步研究。

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