电针夹脊穴对兔退变腰椎间盘Actin、Tubulin表达的影响

李妍玲，邹璟，黄国付,3

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVDD)是一个多因素导致的病理过程，是椎间盘突出、椎管狭窄、脊柱失稳等脊柱退行性疾病的共同病理基础。有研究表明，非生理的生物力学环境及其导致的细胞外基质代谢变化是椎间盘退变的始动因素[1]，而细胞骨架可能作为机械信号传导通路的重要组成部分参与了胞外基质代谢的调节[2]。目前针灸在临床治疗腰椎间盘退行性疾病中备受青睐，前期研究已证明，电针对腰椎间盘退行性疾病有较好的疗效[3]，但其具体机制尚未完全明确。因此，本实验从actin、微管蛋白的角度研究电针对退变椎间盘细胞中细胞骨架蛋白的影响，探讨电针防治腰椎间盘退变性疾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性新西兰大白兔40只，月龄5～6个月，体质量3.0～4.0kg，由武汉大学实验动物中心提供(动物质量合格证编号：42000500005471)，适应性饲养3周后开始实验。

1.2 主要仪器和试剂 轴向加压造模器(十堰东汽)；电钻(型号JIZ-SH09-10C 6910JER，上海锐奇)；Signa HD×3.0T 磁共振器(美国通用)；多功能实验兔固定器(北京创博环球)；针灸针(φ0.30×25mm，华佗牌)；HANS穴位神经刺激仪(南京济生)；TS-1水平摇床(江苏海门其林贝尔)；DYCZ-40电转仪、DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYY-7C电泳仪电源(北京六一)；丙烯酰胺(Amresco)；PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂(碧云天)；PVDF膜(Millipore)；GAPDH抗体(abcam)；一抗(NBP1-41294、NB600-506，novus)；HRP标记羊抗兔二抗、HRP标记羊抗小鼠二抗(novus)；ECL底物液(Thermo)。

1.2 方法 ①分组与造模：采用随机数字表法将40只新西兰大白兔分为正常组、模型组、假模型组、电针组4组，每组各10只。模型组与电针组参考Kroeber M等[4]及黄国付等[5]造模方法建立兔腰椎间盘退变模型。10%水合氯醛(1ml/kg)耳缘静脉注射麻醉后将新西兰大白兔俯卧位固定；备皮后于L4、L5椎体的椎旁两侧约2cm处做长约1cm的垂直切口，钝性分离各层组织，显露椎体；直径1.5mm的克氏针沿切口处钻入至针尖轻抵骨面，探寻相应椎体近尾端厚实处作为穿刺点，用电钻将克氏针水平钻入椎体内并从对侧皮肤穿出，过程中保持针身与脊柱垂直；缝合切口处皮肤，在每根克氏针两端等距处安装轴向加压造模器(图1)，施加200N的压力持续28d(图2)；最后肌肉注射青霉素钠4×106U，1次/d，连续治疗5d。术后28d拆除加压装置、拔除克氏针，4组实验兔每组各取5只进行MRI检查以评价造模是否成功。②动物干预：正常组：自然饲养，不作其他处理和治疗；模型组、假模型组：不作任何治疗；假模型组造模方式同模型组，但不安装轴向加压造模器，不进行椎体间加压；电针组：造模成功后第1天开始电针治疗。参照《实验针灸学》[6]取L4、L5双侧夹脊穴，1寸针灸针(φ0.30×25mm，华佗牌)直刺5～8mm后接以韩氏穴位神经刺激仪(同侧夹脊穴接通同一对电极)，调频波2/15Hz，刺激强度1～2mA，持续时间为20min/次(图3)，1次/d，连续治疗6d为1个疗程，疗程间隔1d，共治疗4个疗程。

图1仅安装轴向加造模器，未施压图2椎体间加压图3电针治疗

1.3 评定标准 每组分别在达到造模周期后第1天和第28天各取5只，拆除加压装置并拔除克氏针，用10%水合氯醛(1ml/kg)耳缘静脉注射麻醉后行L4～5椎间盘MRI平扫，之后处死并取出所需节段椎间盘组织，置于-70℃冰箱中保存供Western blot检测。Western Blot检测MAPs和Actin的表达：按照实验试剂说明书，将所取椎间盘组织洗涤、裂解、离心后收集蛋白样品匀浆，BCA试剂测定蛋白样品的蛋白浓度；按照蛋白分子量配置10%PAGE凝胶，待目的蛋白充分分离即停止电泳，裁取目的凝胶后转膜；将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中室温下摇床封闭2h；再将PVDF膜浸于封闭液稀释(1∶1000)的一抗溶液中，4℃摇床孵化过夜，TBST充分洗涤5～6次；二抗经封闭液稀释(1∶10000)后浸泡PVDF膜，室温下摇床孵化2h后充分洗涤；再将ECL显影液均匀滴在PVDF膜蛋白面，暗室X光片显影；应用Band-Scan凝胶图像处理系统分析tubulin和actin平均吸光度。

2 结果

2.1 磁共振影像检测椎间盘信号变化 术后第28天各组实验兔拆除加压装置并拔除克氏针，使用Signa HD×3.0T 磁共振器摄L4～5椎间盘T2加权(矢状位)像。结果显示：正常组与假模型组实验兔椎间盘各节段表现为均匀明亮的高信号，各椎间盘信号强度无明显差异；模型组与电针组L4～5椎间盘信号强度明显低于上下相邻椎间盘，表现为黑色低信号，与正常椎间盘差异明显，表明成功建立椎间盘退变模型。见图4。

2.2 各组术后actin，tubulin蛋白表达量比较 正常组与假模型组术后不同时间点actin，tubulin表达差异均无统计学意义；模型组术后第28天actin，tubulin表达与该组术后第56天相比差异无统计学意义；模型组及电针组术后第28天actin，tubulin表达与正常组及假模型组术后第28天相比均有明显下降(均P<0.05)；电针组经治疗56d后actin、tubulin表达与该组术后第28d及模型组术后第56天相比均有明显升高(均P<0.05)。见表1，图5，6。

图4 术后第28天各组实验兔椎间盘MRI比较

组别nactin术后第28天术后第56天微管蛋白术后第28天术后第56天正常组51111假模型组50.958±0.0850.951±0.0580.998±0.0591.029±0.087模型组50.539±0.057a0.520±0.105a0.801±0.065a0.863±0.037a电针组50.530±0.155a1.087±0.142bc0.787±0.022a1.298±0.190bc

与正常组及假模型组术后同时间点比较，aP<0.05；与电针组术后第28天比较，bP<0.05；与模型组术后第56天比较，cP<0.05

图5治疗28及56d后4组兔腰椎间盘细胞中actin相对表达量western检测比较

图6治疗28及56d后4组兔腰椎间盘细胞中tubulin相对表达量western检测比较

3 讨论

椎间盘的解剖结构是由纤维环、髓核和软骨终板组成。在正常情况下，椎间盘可分散和缓冲脊柱压力负荷，但髓核和纤维环细胞所承载的应力不完全相同。非生理条件下的机械负荷可能影响髓核和纤维环细胞的合成和分解代谢，进而引起胞外基质的成分变化。椎间盘细胞外基质具有复杂的生物力学性能，其构成的变化可进一步影响椎间盘的力学分布，最终影响椎间盘的形态和结构。因此，非正常机械应力是引起椎间盘退变的最重要原因之一。然而，椎间盘细胞将外界机械力信号转化为生物化学信号从而引起胞外基质成分改变的机制仍不十分清楚。有研究提出，细胞骨架可能在这一信号传导过程中起到重要作用[7]。

细胞骨架蛋白是指细胞质中由蛋白丝组成的非膜相结构系统的蛋白质，椎间盘细胞中的细胞骨架蛋白有actin、tubulin和波形蛋白(vimentin)等。力学信号在细胞内部深层的传导主要通过细胞骨架蛋白实现，机械力刺激作用于椎间盘细胞时，细胞外基质结合细胞骨架，介导细胞内蛋白构象的改变。actin是细胞运动、维持形态、跨膜转运及信号转导等的基础。张德宏等[1]发现，大鼠纤维环细胞actin骨架在静态培养时呈现明显的应力纤维，而不同幅度和时间的牵拉可影响actin骨架的聚合和解聚，提示细胞骨架组成的结构变异对椎间盘细胞的力学功能起到重要作用。于胜吉等[8]发现，椎间盘细胞受到直接外力作用后，actin收缩且表达相应降低，细胞体积缩小，形态发生改变。研究表明，椎间盘细胞受到机械应力时可通过激活Ca2+通道导致细胞内Ca2+瞬间变化，从而引起actin的重塑，有利于渗透性应力下细胞体积的重塑[9]。微管蛋白主要参与细胞内物质转运、维持细胞形态及细胞器定位等功能活动。椎间盘细胞中微管蛋白的表达和分布随年龄的增长出现明显变化，导致其对机械应力的反应发生改变，进而影响胞外基质的代谢。Li等[2,10]研究证实，体外培养的椎间盘细胞在牵张力作用下出现结构和表达的明显改变，当软骨细胞中微管蛋白的表达受到干扰时可抑制压力诱导的蛋白聚糖的合成和分泌。综上所述，生理状况下，细胞骨架蛋白将作用于椎间盘细胞的机械力刺激转化生物化学信号，维持胞外基质的正常代谢平衡；而异常的机械应力可引起细胞骨架蛋白结构及表达发生改变，力学信号转导通路异常，进而影响椎间盘细胞外基质的合成和分解代谢，导致椎间盘的退变。

本实验参考Kroeber等[4]通过压力装置诱发椎间盘退变的造模方法，在相邻两椎体间进行轴向加压，通过过度的机械刺激作用于椎间盘细胞引起细胞骨架蛋白的表达变化，从而建立椎间盘退变模型。实验结果显示，模型组术后第28天、第56天及电针组术后第28天actin、tubulin表达较正常组及假模型组术后第28天、第56天相比均明显下降，说明轴向加压可诱导椎间盘退变的发生，退变的椎间盘细胞中actin、tubulin表达下调；而电针组经电针治疗28d后actin、tubulin表达明显升高，说明电针可有效上调退变椎间盘细胞中actin、tubulin的表达。前期研究表明，电针夹脊穴可通过降低椎间盘组织中基质金属蛋白酶13、增强基质金属蛋白酶组织抑制因子1，纠正基质降解和合成代谢之间的失衡，从而延缓椎间盘退变[11]。因此，我们认为电针可通过上调退变椎间盘细胞中actin、tubulin的表达，促进退变椎间盘细胞骨架恢复，从而调节椎间盘细胞外基质的合成和分解代谢，达到延缓椎间盘退变的作用。有研究认为，胞外刺激如应力刺激等，可通过磷酸化tubulin、actin等增加水通道蛋白(aquaporin，AQPs)mRNA的转录和蛋白合成，从而改变微管、微丝等细胞骨架对AQPs的转运[12-14]。课题组前期研究已证实[15]，退变椎间盘组织中AQP1、3表达降低，而电针可有效上调模型兔退变椎间盘组织中AQP1、3的表达。基于此我们推测，电针可通过上调退变椎间盘细胞中actin、tubulin的表达，进而上调终板软骨细胞AQP1、3表达，从而延缓椎间盘退变。本研究为阐明电针治疗腰椎间盘退行性疾病的可能机制提供了一定的实验依据，为临床应用电针治疗腰椎间盘退行性疾病提供了理论依据，但细胞骨架蛋白与AQPs之间的关系仍待进一步研究。

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