吸烟慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中OLA1表达与氧化应激、内质网应激的相关性分析

冯双双 陈刘通 廖晨 白莉

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是全世界范围内发病率、病死率最高的疾病之一。吸烟是COPD发病的最主要的危险因素。吸烟所致高氧化应激(oxidative stress, OS)状态下肺部结构细胞损伤/凋亡是COPD发生气道重塑、肺气肿的病理学基础[1-5]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)可调控OS状态下细胞存活或凋亡[6-8]。Obg样ATP酶1(Obg-like ATPase1, OLA1)是抗OS的内源性负性调控因子，其表达水平的降低对OS状态下的细胞具有保护作用[9-12]。前期研究也发现下调OLA1的细胞可减轻多种细胞ERS水平[13]。鉴于OS/ERS途径与吸烟相关COPD形成过程中肺部结构细胞的损伤/凋亡密切相关，我们推测从OLA1入手调控OS/ERS有可能逆转香烟暴露下肺部结构细胞损伤/凋亡，阻止COPD的发生。本文通过检测人肺组织中OLA1、OS指标超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malonaldehyde, MDA)及ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein of 78kD, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)表达水平，探讨人肺组织标本中OLA1表达水平与OS水平、ERS活化程度的相关性。

对象与方法

一、研究对象

研究对象肺组织标本来自2014年1月至2015年1月陆军军医大学新桥医院胸外科行肺叶切除术的24例肺癌患者。取材均为伴或不伴COPD并行肺叶切除的肺癌患者临床标本，远离原发癌灶5 cm以上且肉眼观察无肺癌浸润的外周肺组织。根据患者有无吸烟史将病例分为三组，每组各8例，最低年龄42岁，最高年龄72岁。非吸烟肺功能正常组，男6例，女2例，平均年龄(56.37±10.14)岁。吸烟肺功能正常组，男7例，女1例，平均年龄(56.75±2.12)岁。吸烟COPD组，男7例，女1例，平均年龄(60.75±8.55)岁。COPD的诊断符合2013年中华医学会呼吸病学会修订颁布的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》[8]，即患者吸入支气管扩张剂后肺功能FEV1/FVC<70%，且不合并其他慢性疾病，手术前一周均处于稳定期。排除标准：具有除慢性阻塞性肺疾病以外的慢性肺部疾病、糖尿病、冠心病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等。本研究项目经陆军军医大学(第三军医大学)新桥医院伦理委员会审查批准，患者签署知情同意书。

二、研究方法

1. 试剂和仪器： 抗OLA1抗体、抗SOD抗体、抗MDA抗体均购自美国abcam公司，抗CHOP抗体、抗GRP78抗体购自美国Santa Cruz公司，倒置显微镜为日本Olympus公司。

2. 肺组织免疫组化染色及结果判定： 4%多聚甲醛固定肺组织标本，石蜡包埋切片、修复、封闭后滴加Ⅰ抗：抗OLA1抗体(1︰100)、抗SOD抗体(1︰200)、抗MDA抗体(1︰400)、抗CHOP抗体(1︰200)、抗GRP78抗体(1︰200)，PBS漂洗后滴加Ⅱ抗：山羊抗兔抗体(1︰400)，DAB显色，苏木精复染5 min后封片，最后镜检。结果分析：显微镜下观察细胞染色程度(无显色，0分；淡黄色，1分；浅褐色，2分；深褐色，3分)及阳性范围(0～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；76%～100%，4分)，两者分数相乘为最终分数。

三、统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间均数比较应用单因素方差分析，两两比较釆用LSD检验；两指标的相关性采用Pearson线性相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、临床基本资料

三组患者年龄、性别比较均无统计学意义(P>0.05)；吸烟COPD组体重指数明显低于非吸烟肺功能正常组和吸烟肺功能正常组(P<0.05)；吸烟肺功能正常组和吸烟COPD组患者均有长期吸烟史，两组之间无统计学差异(P>0.05)；非吸烟肺功能正常组和吸烟肺功能正常组肺功能FEV1%pred和FEV1/FVC均在正常范围，但吸烟肺功能正常组肺功能较非吸烟肺功能正常组有所下降，吸烟COPD组肺功能明显低于非吸烟肺功能正常组和吸烟肺功能正常组(P<0.05)，见表1。

二、OLA1、氧化应激指标及内质网应激相关蛋白在肺组织中表达情况

免疫组化半定量分析结果显示OLA1、OS指标SOD、MDA及ERS相关蛋白GRP78、CHOP在人肺组织支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中均有表达，OLA1、MDA、GRP78、CHOP在吸烟COPD组和吸烟肺功能正常组中表达明显高于非吸烟肺功能正常组(P<0.05)，吸烟COPD组高于吸烟肺功能正常组(P<0.05)，SOD在吸烟COPD组和吸烟肺功能组中表达明显低于非吸烟肺功能正常组(P<0.05)，吸烟COPD组低于吸烟肺功能正常组(P<0.05)，图1和表2。

三、OLA1表达水平与OS水平、ERS活化程度的相关性分析

Pearson直线相关分析，OLA1在人肺组织中表达与OS指标SOD表达呈负相关(r=-0.643，P<0.01)，与MDA表达呈正相关(r=0.793，P<0.01)；与ERS相关蛋白GRP78呈正相关(r=0.815，P<0.01)、与CHOP表达呈正相关(r=0.843，P<0.01)。

讨 论

吸烟是COPD发病的最重要的危险因素。吸烟所致高OS状态下肺部结构细胞损伤/凋亡是COPD发生气道重塑、肺气肿的病理学基础。既往研究证实由于肺部慢性炎症和支气管上皮细胞损伤，SOD的合成能力下降，SOD活性降低，MDA水平增高，从而导致机体失代偿[14]。有研究证实氧化应激代谢产物MDA在吸烟相关COPD患者血清中表达水平高于非吸烟健康者，抗氧化酶SOD表达水平对比非吸烟健康者明显降低，且MDA与SOD表达水平呈负性相关[15-16]。本文结果发现人肺组织中OS指标MDA在吸烟组患者(吸烟肺功能正常组和吸烟COPD组)肺组织中表达高于非吸烟患者(非吸烟肺功能正常组)，在吸烟COPD患者高于吸烟肺功能正常患者，抗氧化酶SOD表达则与MDA表达相反，SOD在吸烟患者肺组织中的表达低于非吸烟患者，在吸烟COPD患者肺组织中表达低于吸烟肺功能正常患者。本研究结果说明与非吸烟肺功能正常患者相比，吸烟患者肺内OS失衡更严重，提示肺内OS失衡在吸烟相关COPD的发病机制中可能起一定作用。

ERS是调控包括OS等多种应激状态下细胞存活或凋亡的重要途径，研究证实OS、ERS与糖尿病、哮喘、肺纤维化等慢性疾病发病机制相关[3-6,17-24]。大量证据表明香烟烟雾触发肺内ERS并介导肺部细胞损伤/凋亡，参与COPD的发病机制[4,25]。应激条件下，ERS通路被激活，GRP78表达上调，促进内质网中未折叠蛋白正确折叠，以减轻ERS，恢复内质网和细胞内环境的稳态，起到一种细胞保护性机制的作用。CHOP作为一种内质网相关促凋亡蛋白，在过度ERS情况下大量表达，参与细胞损伤/凋亡途径。研究发现CHOP、GRP78在吸烟相关COPD患者肺泡灌洗液中表达增高。研究不吸烟者、吸烟者、吸烟COPD患者肺组织中人支气管上皮细胞(normal human bronchial epithelial cell, NHBE)中GRP78、CHOP表达水平，发现吸烟者与吸烟COPD患者NHBE中GRP78、CHOP表达高于不吸烟者，吸烟COPD患者的表达水平又高于吸烟者[26-29]。与上述研究结果相似，本研究中我们发现GRP78、CHOP在吸烟患者肺组织中表达增高，其中吸烟COPD患者表达高于吸烟肺功能正常患者，本研究结果说明与非吸烟肺功能正常患者对比，吸烟患者肺组织ERS活化程度加重，提示ERS通路激活可能参与了吸烟COPD的发病机制。

表1 三组患者临床基本资料比较

表2 三组患者肺组织中OLA1、SOD、MDA、GRP78、CHOP的表达

图1 OLA1、OS指标SOD、MDA及ERS相关蛋白GRP89、CHOP在人肺组织中的表达(×200)；注：A：非吸烟肺功能正常组；B：吸烟肺功能正常组；C：吸烟COPD组

OLA1是新近确认的抗OS内源性负性调控因子，研究发现下调OLA1表达可减轻细胞内ERS，ERS调控OS可促使细胞存活或者凋亡[30-33]。本究显示OLA1在吸烟COPD患者和吸烟肺功能正常肺组织中表达明显高于非吸烟患者，其中吸烟COPD患者肺组织表达又高于吸烟肺功能正常患者；提示OLA1表达上调可能参与吸烟相关COPD的发病机制。进一步对OLA1表达水平和OS、ERS标志物表达相关性分析显示，OLA1表达水平与OS指标MDA、ERS相关蛋白GRP78、CHOP呈正相关，与OS指标SOD水平呈负相关，提示抗OS负性调控因子OLA1的表达与OS和ERS水平一致，表明OLA1可能是通过调控OS/ERS调控肺部结构细胞损伤/凋亡，进而参与COPD的发生。

综上所述，OLA1可能是通过调控OS/ERS调控肺部结构细胞损伤/凋亡，进而参与COPD的发生。对其进行深入研究有助于揭示OLA1、OS、ERS在吸烟相关COPD发病中的作用机制，对了解吸烟相关COPD的发病和治疗具有重要意义。