基于近红外光谱分析技术结合化学计量学方法的初烤烟叶霉变预测研究

周继月，杨盼盼，刘磊，尹晓东，侯英，杨式华

1 云南省烟草烟叶公司 技术中心 昆明 651208；

2 云南同创检测技术股份有限公司 研发中心 昆明 650106

由于烟叶采收的季节性和打叶复烤的计划性，初烤烟叶复烤前需存储一段时间，存储过程中烟叶由于受到环境温湿度及存储条件的影响容易发生霉变[1-2]，给烟草复烤加工企业带来巨大的经济损失，因此如何有效对初烤烟叶霉变进行预警对预防烟叶霉变具有较好的应用价值。现有文献[3-5]多以环境温湿度和烟叶含水率为自变量进行烟叶霉变预测。上述方法多基于烟叶所处的环境和含水率，缺乏对霉变过程烟叶内在化学成分变化的规律研究。

烟叶霉变过程伴随着烟叶携带霉变微生物孢子萌发、生长和繁殖等过程[6]，上述过程中微生物代谢产生的次级代谢产物往往对烟叶霉变过程具有较好的指示性作用。麦角甾醇作为一种植物甾醇可以用来监控烟草早期霉变[7-8]。目前麦角甾醇含量检测方法包括：薄层色谱[9]、高效液相色谱[10]和气质联用[7]。烟草中麦角甾醇含量测定多采用气质联用[7]。上述方法存在前处理复杂、检测周期长等缺点。近红外光谱分析技术作为一种简便、快速、无损的检测方法已被应用于不同基质中真菌毒素的定量检测[11]。国内外的研究者已经将近红外分析技术应用于小麦[12]、玉米[13]和土壤[14]中麦角甾醇含量的快速测定，取得了较好的应用效果，因此采用近红外光谱分析技术快速表征烟叶霉变过程中的麦角甾醇含量具有一定可行性。

近红外光谱分析技术通过结合化学计量学方法，建立定量及定性模型实现对烟草中化学成分含量测定及含量变化趋势的预测[15-16]。为提高近红外建立模型的稳定性和预测精度，应对特征变量有效信息进行筛选[17]。由于筛选出来的近红外光谱信息往往具有多维性，需结合主成分分析将多维信息反映到较少的新变量上，通过分析新变量达到多元统计监测物质化学成分含量的变化趋势，已经应用在许多领域[18]。Hotelling T2检验是主成分分析中一种常用多变量检验方法，是单变量检验的自然推广，常用于两组均向量的比较[19]。

鉴于此，调节烟叶含水率和环境温湿度，通过肉眼识别烟叶是否出现霉变及检测初烤烟叶霉变过程中的麦角甾醇含量和近红外光谱信息，并采用化学计量学方法竞争自适应重加权[20](Competitive Adaptive Reweighted Sampling Method,CARS)筛选出近红外光谱中对烟叶麦角甾醇含量“敏感”的光谱信息，本研究拟首次建立基于上述近红外光谱信息的主成分分析和Hotelling T2统计量的烟叶霉变预警定性模型，以期为初烤烟叶霉变的准确、快速预警提供一种切实可行的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

20个烟叶样品来源于2015年和2016年云南5个地区(临沧、普洱、昆明、曲靖和文山)2个等级(B2F和C3F)的初烤烟叶，由云南烟草烟叶公司技术中心提供，详细的样品信息如表1所示。

表1 初烤烟叶样品序号、年份、地区及等级信息Tab.1 Sample information including sequence number,year,producing area and grades

KBF240恒温恒湿箱(德国Binder公司)；GC6890N/MS5975C气质联用仪(美国Agilent)；Nicolet Antaris II型FT-NIR近红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)；AE200型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；CT410旋风磨(丹麦Foss公司)。

1.2 方法

1.2.1 烟叶霉变实验

参照文献[21]对初烤烟叶样品的烟叶含水率进行调节，采用烘箱干燥法[22]测定烟叶含水率，使烟叶含水率达到18％(误差±0.3％)。将预处理后的初烤烟叶样品放入恒温恒湿箱，调节温、湿度分别为28℃和80％条件下进行烟叶霉变实验，以30天为实验周期，2天取样一次。

1.2.2 麦角甾醇含量测定

参照文献[7]方法检测初烤烟叶麦角甾醇含量。

1.2.3 近红外光谱数据的采集

取实验过程中的1～2整片烟叶样品，旋风磨粉碎，过60目筛。参照标准方法[23]采集初烤烟叶样品近红外光谱数据。其中第0d的样品平行采集6份，用于建立主成分分析模型；第3d至第30d样品采集1份，用于输入主成分模型，提取Hotelling T2统计量进行烟叶霉变预测。上述样品均重复取样3次采集近红外光谱，以平均光谱作为样品光谱。

1.2.4 光谱预处理及特征波长范围筛选

近红外光谱预处理，采用多元散射校正(MSC)+二阶求导+Norris(5,5)平滑光谱方法对近红外光谱进行预处理，用于消除粉末样品颜色、粒径和仪器硬件性能对近红外光谱基线漂移和噪声的影响[24]，上述过程由TQ Analyst 9.3(美国Thermo Fisher公司)软件完成。

波长变量筛选，采用竞争自适应重加权(CARS)方法筛选出预处理后的近红外光谱数据中与麦角甾醇含量强相关性波长变量范围，用于提高主成分分析的指征性[25]。CARS算法主要参数：最大主成分数为15、蒙特卡罗运算样本数为50、交互验证样本数5、运行次数100；变量重要性评价指标为算法运行100次，统计每个变量被选中的概率，基于模型的内部交互验证，选取被选频率前200波长变量进入主成分分析，上述过程由MATLAB 6.0(Mathwork,USA)软件完成。

1.2.5 主成分分析和基于Hotelling T2统计量的监测模型建立

将上述筛选出的波长变量导入SIMCA-P+11.5(Umetrics,Sweden)软件进行主成分分析，通过提取Hotelling T2统计量，建立监测模型，以Hotelling T2统计量的95％置信限作为初烤烟叶霉变预警限，用于对初烤烟叶霉变预警。

2 结果

2.1 烟叶霉变实验

2015年和2016年云南5个地区(临沧、普洱、昆明、曲靖和文山)2个等级(B2F和C3F)的初烤烟叶在30d实验周期内霉变程度及出现肉眼可见霉变天数如表2所示。由表2可知，20个初烤烟叶样本中出现霉变的样本为13个(其中霉变10个，轻微霉变3个)，未霉变烟叶7个，典型的霉变、轻微霉变、未霉变和肉眼可见霉变烟叶如图1所示。

表2 初烤烟叶样品实验周期内霉变程度及肉眼可见霉变时实验天数Tab.2 Degree of flue-cured tobacco leaf mildew and the time of macroscopic tobacco mildew

图1 典型的霉变、轻微霉变、未霉变和肉眼可见霉变初烤烟叶图Fig.1 Typical pictures of tobacco serious mildew,slight mildew,no mildew and macroscopic mildew

2.2 烟叶霉变过程中麦角甾醇含量变化规律

2015年和2016年云南5个地区(临沧、普洱、昆明、曲靖和文山)2个等级(B2F和C3F)的20个初烤烟叶样本30d实验周期内麦角甾醇含量如表3所示。由表3可知，30d霉变实验周期内发生霉变的初烤烟叶麦角甾醇含量出现先逐渐增加后逐渐降低的趋势，当肉眼可见时，麦角甾醇含量较初始值增加4.66～23.38倍；30d霉变实验周期内未发生霉变初烤烟叶含量变化小。注：表中数字加黑表示烟叶表面开始出现肉眼可见霉变；增加倍数表示肉眼可见霉变时烟叶麦角甾醇含量/0d时该样品的麦角甾醇含量。

表3 初烤烟叶样品30d实验周期内麦角甾醇含量Tab.3 Content of ergosterol of flue-cured tobacco leaf within the 30-days experiment period µg/g

2.3 麦角甾醇含量强相关性近红外光谱范围的筛选

采用多元散射校正(MSC)+二阶求导+Norris(5,5)平滑光谱方法预处理前后初烤烟叶近红外光谱如图2所示。采用CARS方法计算波长变量重要性参数如图3所示。由图3可知，近红外光谱信息中对初烤烟叶麦角甾醇含量“敏感”光谱主要波长范围为4180-4200cm-1、5083-5095cm-1、5349-5372cm-1、5696-5719cm-1、6255-6267cm-1、6390-6417cm-1、6444-6475cm-1、6610-6633cm-1、6819-6849cm-1、7494-7501cm-1、7744-7764cm-1、7802-7821cm-1、7856-7887cm-1、7949-7995cm-1、8138-8154cm-1和8782-8801cm-1。

2.4 基于Hotelling T2统计量的烟叶霉变预测模型

以2016年曲靖B2F烟叶未霉变、2016年临沧B2F烟叶轻微霉变、2015年普洱C3F烟叶霉变3个样品的Hotelling T2统计量过程为列，其模型监测图如图4-图6所示。

图2 初烤烟叶霉变过程中原始的近红外光谱(a)和预处理后的光谱(b)Fig.2 Typical raw(a)and Pretreatment(b)near infrared spectroscopy of tobacco

图3 CARS筛选出的变量(波数)重要性频率Fig.3 Screened spectrum rang of CARS

图4 基于Hotelling T2统计量的烟叶未霉变过程监测图Fig.4 Hotelling T2 monitor graph of no mildew of tobacco

由图4可知，2016年曲靖B2F初烤烟叶样品第0d的6个建模样品(图中以实心方点标识)均在Hotelling T2的95％置信期间内；第3d至第30d的10个预测样品(图中以实心三角形标识)亦均在Hotelling T2的95％置信期间内。由表2可知，该样品30d实验周期内未见肉眼可见烟叶，模型未出现预警信号。

图5 基于Hotelling T2统计量的烟叶轻微霉变过程监测图Fig.5 Hotelling T2 monitor graph of slight mildew of tobacco

由图5可知，2015年临沧B2F初烤烟叶样品第0d的6个建模样品(图中以实心方点所示)均在Hotelling T2的95％置信期间内；第3d～21d的7个预测样品(图中以实心三角形所示)均在Hotelling T2的95％置信期间内；第24d样品预测点开始超出Hotelling T2的95％置信期间；第27d和30d样品预测点均超出Hotelling T2的95％置信期间。由表2可知，该样品肉眼可见的霉变天数为30天，模型的预警天数为24天，实现了对霉变过程预警提前6天。

图6 基于Hotelling T2统计量的烟叶霉变过程监测图Fig.6 Hotelling T2 monitor graph of serious mildew of tobacco

由图6可知，2015年普洱C3F初烤烟叶样品第0d的6个建模样品(图中以实心方点标识)均在Hotelling T2的95％置信区间内；第3d、6d和9d的3个预测样品(图中实心三角形标识)均在Hotelling T2的95％置信期间内；第12d样品预测点开始超出Hotelling T2的95％置信期间；第15d～30d样品预测点均超出Hotelling T2的95％置信期间。由表2可知，该样品肉眼可见的霉变天数为15天，模型的预警天数为12天，实现了对霉变过程预警提前3天。

2015年和2016年云南5个地区(临沧、普洱、昆明、曲靖和文山)2个等级(B2F和C3F)中初烤烟叶在30d实验周期内出现肉眼可见霉变天数及Hotelling T2统计模型预警天数如表4所示。由表4可知，13个霉变烟叶中出现Hotelling T2统计模型预警天数先于肉眼可见霉变天数有9个样品，提前预警天数为6天的样品2个，占总霉变样品总数的15.38％；提前预警天数3天的样品7个，占总霉变样品总数的53.85％；当天预警的样品4个，占总霉变样品总数的30.77％；7个未发生霉变烟叶在30天的监测周期内均未出现预警，预测准确率100％。

表4 实验周期内肉眼可见烟叶霉变时实验天数及Hotelling T2统计模型预警天数Tab.4 Time of macroscopic and model pre-warning tobacco mildew

3 讨论

目前文献[26-27]报道的烟叶霉变预测多基于存储环境温湿度，缺乏对烟叶本身理化性质影响烟叶霉变的考量。基于烟叶麦角甾醇含量变化，采用近红外光谱分析结合化学计量学方法建立烟叶霉变过程的模式识别模型，对烟叶霉变过程具有较好预警效果。本研究结构表明初烤烟叶霉变过程中麦角甾醇含量呈现逐渐增加后逐渐降低的变化趋势，与文献[28]报道的结果相符合。采用近红外光谱能定量分析烟叶中麦角甾醇含量[29]表明近红外光谱中存在对麦角甾醇含量“敏感”的光谱信息。本文应用近红外光谱预测烟叶霉变具有一定的合理性和可操作性。

较烟叶麦角甾醇近红外光谱分析定量分析，本研究针对单个烟叶样品采用过程模式识别监测初烤烟叶霉变过程中麦角甾醇含量变化，能较好的排除烟叶地区、部位和等级差异对建立近红外模型无关背景光谱信息的影响。在实际应用方面，较定量模型，定性模型不需繁杂的麦角甾醇含量化学测定步骤，能提高近红外预测初烤烟叶霉变效率。为提高近红外光谱分析技术预警初烤烟叶霉变的效果可筛选更“灵敏”反映烟叶霉变过程且与近红外光谱信息密切相关的霉变标志物。

为有效防止生产现场烟叶霉变的发生，基于上述预警结果，可根据烟叶产地、部位和含水率划分防霉等级，针对不同防霉等级烟叶，采用不同的堆垛架、堆垛高度和烟堆覆盖材料，同时制定不同强度的烟堆温湿度监测强度。对发现肉眼可见霉变烟堆采用物理去除霉变烟叶和翻垛等的措施。

4 结论

(1)烟叶霉变过程中，麦角甾醇含量逐渐增加后逐渐降低，当肉眼可见时，麦角甾醇含量较初始值增加4.66～23.38倍；

(2)通过波长筛选，烟叶麦角甾醇含量“敏感”近红外光谱主要波长范围为4180-4200cm-1、5083-5095cm-1、5349-5372cm-1、5696-5719cm-1、6255-6267cm-1、6390-6417cm-1、6444-6475cm-1、6610-6633cm-1、6819-6849cm-1、7494-7501cm-1、7744-7764cm-1、7802-7821cm-1、7856-7887cm-1、7949-7995cm-1、8138-8154cm-1和8782-8801cm-1；

(3)采用基于麦角甾醇含量的近红外光谱信息主成分分析Hotelling T2监测模型，13个霉变的烟叶样品中，提前预警天数为6天的样品2个，占总霉变样品总数的15.38％；提前预警天数3天的样品7个，占总霉变样品总数的53.85％；当天预警的样品4个，占总霉变样品总数的30.77％；7个未发生霉变烟叶在30天的监测周期内均未出现预警，预测准确率100％。该方法能方便快速的实现对初烤烟叶霉变预警，具有较好的实用价值。

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