采收时期及调制方式对万源晒烟调制前后氨基酸含量变化的影响

李晶晶，史宏志，杨兴有，杨吉光，李传胜，郑昕，王俊

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州市文化路95号 450002；

2 四川省烟草公司达州市公司，四川省达州市柴市街212号 635000

氨基酸是烟草中的重要化合物之一，在烟草的生长、调制、醇化、工业加工直至抽吸过程中都起着十分重要的作用[1-3]，它既是合成蛋白质的原料，又是蛋白质的降解产物，同时也是合成烟碱、多酚等物质的前体，对烟株体内碳氮代谢及烟叶品质贡献很大。氨基酸在烟株体内大多结合在蛋白质中，除此以外，还有一部分非蛋白氨基酸以游离态形式存在。游离氨基酸和蛋白质降解产生的氨基酸与糖类化合物发生非酶棕色化反应是烟叶香味物质的重要来源[4-8]，研究烟叶在不同生育时期、叶位以及调制前后烟叶中氨基酸含量的变化规律对烟草栽培理论和烟叶品质的提升具有指导作用。烟草中氨基酸的含量在不同类型烟草及品种间并不相同，而且受环境、栽培措施及调制方式的影响较大。在游离氨基酸方面，有研究表明[9]白肋烟、香料烟和烤烟的烟叶中所含游离氨基酸总量及所含主要游离氨基酸种类上均存在显著差异。符云鹏等[10]对烤烟不同叶片发育过程中游离氨基酸总量变化的研究结果表明，烟叶中游离氨基酸总量在生育期的变化趋势是幼叶含量高，进入成熟期后明显下降。Weybrew等[11]报道，烟叶在调制过程中，总游离氨基酸含量逐渐增加，调制后的烟叶含有44种氨基酸，其中以脯氨酸和天门冬酰胺的含量最多。在总氨基酸方面，孙红恋等[12-13]研究表明总氨酸含量与砍收期相关性未达到显著水平，且晾制前砍收越早，蛋白质完全水解的总氨基酸含量越多。王爱华等[14]研究显示烘烤过程中阶梯升温变黄处理有利于变黄末期及烤后烟叶大部分Amadori有关的氨基酸及其他种类氨基酸含量的积累，利于香气质、香气量及评吸质量的提高。赵铭钦等[15]研究发现烟叶着生部位不同，蛋白质的降解程度和氨基酸的积累程度明显不同，因此可把氨基酸在成熟期间总量的动态变化作为烟叶适熟采收的一个参考标准。

虽然前人对烟叶中氨基酸含量变化规律研究较多，但对晒红烟氨基酸含量变化的研究较少，尤其是不同采收期和调制方式下烟叶中氨基酸含量的变化鲜有报道。万源晒烟以晒红烟万毛3号品种为主，颜色多呈深褐色或红黄色，光泽鲜明，油分充足，身份中等至较厚，弹性较强，烟碱等含氮化合物高，含糖低，烟气香味浓厚丰满，劲头和刺激性大，主要用作雪茄原料，也可用于雪茄型卷烟和混合型卷烟中，鼻烟中亦可使用。虽然近年来烤烟的发展对晒烟产业造成了一定的冲击，但由于国内烟叶政策性调控和国际控烟的影响，对于不同类型烟叶的使用出现了新的趋势，特别是晾晒烟在烤烟型卷烟制品降焦减害方面的使用成为了当前一个热点。本文以晒红烟万毛3号为材料，研究了不同采收期和调制方式下烟叶调制前后总氨基酸含量和比例的变化，揭示不同时期烟叶中氨基酸含量的变化规律，为生产中制订合理栽培及调制措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种为晒烟品种万毛3号。

1.2 试验设计与方法

试验设置在四川省万源市草坝镇，植烟密度为16667株/hm2，行株距1.2m×0.5m，施氮量225kg/hm2。试验烟株5月5日移栽，7月4日(移栽后60d)打顶。试验设置采收时期和调制方式2个因素，采收时期设打顶后25d、30d、35d、40d采收4个水平，分别进行晾制和晒制，共8个处理，试验设置3次重复。

取样：各处理上二棚烟叶均在采收和调制结束时取样。将所取样品烘干后磨碎过孔径0.25mm的筛，取混合样品10g用于测定氨基酸含量。

1.3 氨基酸含量测定

采用S-433 D型全自动氨基酸分析仪(德国SYKAM公司)按照GB/T 5009.124-2003标准测定烟叶中氨基酸含量，结果为蛋白质水解产生的游离氨基酸及烟叶本身存在的游离态非蛋白氨基酸的总和。具体检测方法如下：首先称量0.1000g烟末于水解管中，之后加入10mL 6mol/L的盐酸和新蒸馏的苯酚3～4滴，将水解管放入冷冻剂中3～5min，再抽真空充入高纯氮气；重复3次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在(110±1)℃的恒温干燥箱内，水解22h后取出冷却。将水解液过滤后全部转移到100mL容量瓶中定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2mL水溶解，再干燥，反复进行2次，最后蒸干，用1mL pH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。

1.4 数据分析

试验数据用Excel 2010进行成对数据t测验；用SPSS 22.0软件单(多)因素方差分析和Duncan多重比较法进行统计分析，使用DPS软件欧式距离最长距离法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 采收时期对新鲜烟叶氨基酸含量的影响

试验结果表明，不同采收时期鲜烟叶氨基酸含量差异显著(表1)。鲜烟叶中总氨基酸含量平均值为147.9mg/g，变化范围在140.8～155.6mg/g之间，随采收期推迟呈先下降后上升的趋势，打顶后35d采收含量最低，为140.8mg/g，打顶后25d采收含量最高，为155.6mg/g。

鲜烟叶中含量最多的氨基酸为谷氨酸，其含量在16.4～21.0mg/g范围内，平均18.5mg/g，占氨基酸总量11.4％～13.8％，变化趋势表现为随采收期推迟先升高后降低，打顶后30d采收含量最高，打顶后40d采收最低。其次是天冬氨酸，其含量随采收期的推迟先减少后增加，打顶后25d采收含量最高，打顶后35d采收最低，变化范围在14.4～17.3mg/g之间，平均15.9mg/g，占氨基酸总量10.2％～11.1％。其余氨基酸含量较低，均不超过15mg/g，占氨基酸总量比例在10％以下。总体来看，打顶后35d采收的烟叶氨基酸含量与其他采收时间相比差异明显，天冬氨酸、谷氨酸等多种氨基酸及氨基酸总量差异达到显著水平。

2.2 采收时期和调制方式对调制后烟叶氨基酸含量的影响

2.2.1 采收时期和调制方式对调制后烟叶氨基酸含量的影响

试验结果显示，采收时期和调制方式对调制后烟叶氨基酸含量的影响均存在显著差异(表2，表3)。调制后烟叶氨基酸总量降至99.3～107.3mg/g，平均104.0mg/g，降幅29.7％。其中含量最多的氨基酸为天冬氨酸，其含量随采收期的推迟先增加后减少，变化范围在19.7～28.8mg/g之间，平均24.5mg/g，比调制前增加8.7mg/g，增幅28.9％。其次是谷氨酸，其含量随采收期推迟先降低后升高，变化范围在13.9～16.2mg/g之间，平均15.0mg/g，比调制前降低3.5mg/g，降幅18.9％。其余氨基酸含量较低，均不超过10mg/g。

表1 采收时期对调制前烟叶氨基酸含量的影响Tab.1 Effect of harvesting time on amino acids content in tobacco leaves before curing

调制方式对氨基酸总量的影响虽没有达到显著水平，但氨基酸总量随采收期推迟的变化趋势有一定差异。晾制条件下随采收期推迟氨基酸总量呈持续上升趋势，晒制条件下则呈先上升后下降趋势。对于采收较早的烟叶，晒制有利于提高其氨基酸含量，特别是天冬氨酸含量，打顶后25、30d采收的烟叶晒制后天冬氨酸含量约比晾制增加5.6mg/g，增幅24.14％～28.93％；打顶后35、40d采收的烟叶则表现为晒制低于晾制。谷氨酸含量多表现为晒制高于晾制。

表2 不同采收时期和调制方式烟叶调制后的氨基酸含量Tab.2 The content of amino acids in tobacco leaves after different harvesting time and curing method mg/g

表3 采收时期和调制方式对氨基酸含量影响两因素方差分析表Tab.3 Two factor analysis of effects of harvesting time and curing method on amino acid content

2.2.2 采收时期和调制方式对调制后烟叶氨基酸比例的影响

试验结果表明，在各采收时期占氨基酸总量比例最大的均为天冬氨酸，变化范围为19.8％～27.5％；其次是谷氨酸，占氨基酸总量比例为13.0％～15.5％；苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、脯氨酸占氨基酸总量比例为5％～10％；其余氨基酸占氨基酸总量比例较低，不超过5％。采收时期及两因素互作对各氨基酸比例影响均达到显著水平。调制方式对天冬氨酸的占比影响较大，达到极显著水平，晒制有利于提高早采烟叶的天冬氨酸含量，但随采收时间推迟，晒制后天冬氨酸比例下降幅度较大；其余16种氨基酸的比例受调制方式影响较小，但除苯丙氨酸外均达到显著水平(表4，表5)。

表4 不同采收时期和调制方式烟叶调制后的氨基酸比例Tab.4 The ratio of amino acids in tobacco leaves at different harvesting time and by different curing methods ％

2.3 采收时期和调制方式对调制前后烟叶氨基酸含量变化的影响

对采收时期和调制方式影响烟叶调制前后氨基酸含量变化的试验表明，除胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸差异不显著外，其余氨基酸在调制前后的差异均达到显著水平，其中天冬氨酸、亮氨酸及氨基酸总量在调制前后的差异达到极显著水平(表5)。同一调制方式下，天冬氨酸、谷氨酸调制前后的变化量随采收期推迟均呈先增加后减少的变化趋势，亮氨酸、苯丙氨酸的变化量则随采收期推迟持续降低。

对同一采收时期两种调制方式下的变化值进行成对数据的t测验，结果表明虽然氨基酸总量受调制方式影响未达到显著水平，但各氨基酸对调制方式的反应不同，除天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的变化量表现为晒制高于晾制外，其余类型氨基酸均表现为晾制高于晒制，其中，天冬氨酸在两种调制方式下的增加量差异达到了显著水平。

烟叶调制前后氨基酸变化量的聚类分析结果显示，在相似性系数为27.50处，可将调制过程中唯一含量大幅增加的天冬氨酸与其余16种氨基酸划分开，而其余的16种氨基酸在适当的相似性系数处则能很清晰的聚为3组(图1)。其中胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸变化量最小，约0～2mg/g，亮氨酸变化量最大，约6～9mg/g，其余氨基酸的变化量适中，在2～6mg/g之间。

表5 不同采收时期和调制方式烟叶调制前后氨基酸变化情况分析Tab.5 Analysis of amino acid changes before and after curing of tobacco leaves at different harvesting time and by different curing methods mg/g

图1 17种氨基酸的聚类分析树状图Fig.1 Dendrogram derived from the longest distance cluster analysis of 17 amino acids

3 讨论

在烟叶生长发育和成熟衰老过程中，叶片氨基酸含量和组成不断发生变化，且与碳氮代谢水平密切相关，进而对烟叶香味品质产生影响[1-2]。晒烟鲜烟叶中含量最高的是天冬氨酸和谷氨酸，其中谷氨酸是植物体内氮同化途径中的第一个含氮化合物，为其他氨基酸进行生物合成提供氨基(-NH)[16]，天冬氨酸是天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸的合成前体。本试验结果显示，采收时期对鲜烟叶中的谷氨酸、天冬氨酸及氨基酸总量有显著影响，各氨基酸及氨基酸总量在打顶后35d降至最低；采收时期对调制后烟叶中氨基酸总量和天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸等影响较大，对组氨酸等含量影响较小，调制后氨基酸含量随采收期推迟呈现增加后降低趋势，以打顶后35d较高。以上研究结果表明采收时期与烟叶调制前后氨基酸含量变化关系密切，适时采收对调控烟叶中的氨基酸含量作用很大，这与柴家荣等[16]的研究结果一致。

晒烟烟叶在调制过程中，鲜烟叶内含物质在外界温、湿度作用下发生复杂的生理与生物化学变化，这种变化过程与环境条件密切相关，采取适宜的调制方式和技术，不仅有利于调制优质烟叶，还可对烟叶风格产生一定影响，对满足卷烟企业不同风格卷烟生产具有现实意义。本试验研究了晾、晒两种调制方式对调制后烟叶氨基酸含量的影响，结果表明，受调制方式影响最大的是天冬氨酸，其次是谷氨酸、苯丙氨酸及氨基酸总量，其中天冬氨酸含量在调制后大幅增加，而其他多数氨基酸含量显著下降，这与本课题组对白肋烟及其他晾晒烟的研究结论相似[17]，因此高天冬氨酸比例可能是典型晾晒烟的共同特点。天冬氨酸占总氨基酸的比例也可作为反应晾晒烟风格典型性的一个指标，同时也可反映烟叶调制过程中物质的转化程度和质量表现[17-18]。鉴于以上分析，在打顶后30～35d采收更有利于彰显万源晒烟风格特色，提升烟叶品质，其中成熟度低的烟叶宜采用晒制方式，而成熟度高的烟叶则宜采用晾制方式。关于烟叶晾晒过程中天冬氨酸含量增高的机理尚需进一步研究。

4 结论

万源晒烟鲜烟叶以谷氨酸和天冬氨酸为主，其中谷氨酸含量随成熟度增加先升高后降低，天冬氨酸含量则先降低后升高。调制后氨基酸总量比鲜烟叶显著降低，且氨基酸组成发生较大变化，调制后天冬氨酸大幅增加，而谷氨酸等大多数氨基酸调制后显著降低，高天冬氨酸比例是万源晒烟化学组成的显著特点。采收时期和调制方式对烟叶中氨基酸组成比例及氨基酸总量的变化影响较大，随采收期推迟，氨基酸总量呈增加趋势，晾制时持续升高，晒制则呈先上升后下降趋势。调制方式影响最大的是天冬氨酸，烟叶成熟度低时晒制烟叶天冬氨酸含量高于晾制烟叶，成熟度高时则是晾制高于晒制。通过控制成熟度和选择调制方式有利于生产特色优质晒烟以满足卷烟风格的多样化需要。

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