补中益气汤对念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护作用

林通++张玉奇+李小悦

[摘要]目的 探讨补中益气汤对念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护作用和机制。方法 40只雄性昆明小鼠经环磷酰胺（CTX）预处理后腹腔注射白念珠菌混悬液，制作念珠菌感染小鼠模型，分成对照组（n=20）和试验组（n=20）。对照组给予抗真菌治疗，试验组给予抗真菌联合补中益气汤治疗，观察两组生存率、线粒体生成指标（PGC-1α mRNA）、氮化应激指标（NO、总NOS、iNOS）和肝脏病理。结果 试验组生存率显著高于对照组，差异有统计学意义（70% vs. 30%，P=0.011）。试验组PGC-1α mRNA显著高于对照组（P<0.05）；试验组氮化应激指标显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。光镜下试验组小鼠肝脏肝窦充血较对照组减轻。结论 补中益气汤通过抑制氮化应激保护念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能，促进肝细胞线粒体生成。

[关键词]念珠菌感染；补中益气汤；线粒体；氮化应激

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）1（c）-0117-03

Protective effect of Buzhong Yiqi Decoction on liver mitochondrial function in mice infected by candida albicans

LIN Tong1 ZHANG Yu-qi2 LI Xiao-yue2

1.Family Planning Service Center，Maternal and Child Health Care Hospital of Pingyuan County，Guangdong Province，Pingyuan 514600，China；2.Department of Critical Care Medicine，the Second Affiliated Hospital，Guilin Medical College，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin 541199，China

[Abstract]Objective To discuss the protective effect of Buzhong Yiqi Decoction on liver mitochondrial function in mice infected by candida and its mechanism.Methods 40 male Kunming mice were given intraperitoneal injection of candida albicans suspension after pretreatment by CTX and then made into models infected by candida albicans and were randomly divided into the control group （n=20） and experimental group （n=20）.Mice in the control group were given Antifungal therapy，while mice in the experimental group were given antifungal drug combined with Buzhong Yiqi Decoction.The survival rate，mitochondriopoiesis index，nitrosative stress index and hepatic pathology were observed.Results Survival rate was significantly higher in the experimental group than that in the control group（70% vs. 30%，P=0.011）.The level of PGC-1α mRNA was significantly higher in the experimental group than that in the control group（P<0.05）.The nitrosative stress index was significantly lower in the experimental group than in the control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion of hepatic sinusoid observed by light microscope was lighter in the experimental group than that in the control group.Conclusion Buzhong Yiqi Decoction may protect the liver mitochondrial function and facilitate mitochondriopoiesis in mice infected by candida albicans via inhibition of nitrosative stress.

[Key words]Candida infection；Buzhong Yiqi Decoction；Mitochondria；Nitrosative stress

念珠菌感染病機特点为本虚标实，邪盛正衰[1]。补中益气汤为宋代李杲《内外伤辨惑论》之方剂，具有补中益气、升阳举陷之功，是临床上治疗脾虚证的经典方剂[2]。研究表明，补中益气汤可提高脾气虚动物模型免疫器官指数，有助于提高免疫功能[3]。念珠菌感染容易发展为多器官功能不全综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），其中肝脏是最常见的受损器官之一[4]。线粒体结构和功能的改变参与了脓毒症发生、发展的过程[5]。本研究主要探讨补中益气汤对念珠菌感染动物模型肝脏线粒体的保护作用和可能机制。endprint

1对象与方法

1.1实验动物

昆明小鼠共40只（雄性，体重20～25 g），由中山大学实验动物中心提供[6][SCXK（粤）2009-0011]。实验开始前2 d予环磷酰胺预处理，剂量分别为200 mg/kg、100 mg/kg；实验开始后第4天予环磷酰胺200 mg/kg。白念珠菌（ATCC90028，沙保弱培养基37℃培养48 h）配制标准混悬液（1×109 cfu/ml），采用腹腔注射白念珠菌混悬液方法建立念珠菌感染动物模型。

1.2主要仪器与试剂

参照2010年《中华人民共和国药典》，中药复方包括黄芪30 g，升麻6 g，柴胡6 g，边条参10 g，炙甘草15 g，当归6 g，橘皮6 g，白术10 g。所有药材均购自广州市药材市场，经鉴定为正品。生药加适量水浸泡0.5～1.0 h，煎煮2次（1.5、1.0 h），合并滤液，然后将药物浓缩至生药1 g/ml，4℃保存以备用。

1.3实验分组及处理[6]

雄性昆明小鼠40只随机分为对照组和试验组，每组20只。对照组和试验组均给与抗真菌药物灌胃治疗[伊曲康唑口服液（西安杨森），50 mg/kg，q12 h，稀释成1 ml溶液]。试验组同时给予补中益气汤4 g/（kg·d）灌胃。对照组给予等量生理盐水灌胃。取0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm肾组织匀浆，沙保弱培养基37℃培养48 h，进行白念珠菌菌落计数。动物模型建立后第7天处死实验动物。组织标本采集后储存于-80℃冰箱中。

1.4观察指标及检测方法

实验第7天记录两组生存例数，计算生存率。RT-PCR检测PGC-1α mRNA表达丰度。ELASA（南京建成生物工程研究所）检测氮化应激指标（NO、总NOS、iNOS）。取肝脏组织0.2 cm×0.2 cm×0.3 cm，固定后切片，光镜观察肝脏形态学变化。

1.5统计学方法

采用SPSS 21.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组小鼠生存率的比较

试验组第7天小鼠生存率为70%，显著高于对照组的30%，差异有统计学意义（P=0.011）。

2.2两组小鼠PGC-1α和氮化应激指标的比较

试验组小鼠PGC-1α mRNA显著高于对照组（P<0.05）；试验组小鼠氮化应激指标显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.3两组小鼠光镜病理的比较

对照组小鼠光镜下可见肝窦充血、细胞肿胀、部分呈空泡样改变，局部可见少量白细胞移行。试验组肝窦充血、细胞肿胀较对照组减轻，空泡样改变较对照组减轻（图1）。

3讨论

近年来，念珠菌感染已占院内感染的13.2%，越来越受到临床重视[7]。本研究前期研究显示，免疫功能低下参与念珠菌感染的发生和发展，提高免疫功能可以改善念珠菌感染小鼠7 d生存率。免疫防御是西医范畴中对机体抵抗微生物侵袭这一重要生理功能的描述。在中医范畴中，将这一生理功能表述为正气防御外邪。卫气是肺、脾、肾功能协调旺盛的结果，可以发挥正气防御外邪的作用。中医学认为，卫气与肾、脾、肺有关，关键又在于脾[8]。

中医学认为，中医脾与淋巴免疫功能密切相关[9]。《脾胃论》指出“内伤脾胃，百病由生”。脾不仅主运化水谷精微，为后天之本，且能行使防御机能[1]。念珠菌感染多因年老、久病、长期卧床、外伤等原因致肺脾亏虚，痰湿、痰热等外邪乖虚而入，肺失宣降、脾失健运发所致[2]。故念珠菌感染病机特点为本虚标实，邪盛正衰。补中益气汤为宋代李杲《内外伤辨惑论》之方剂，具有补中益气、升阳举陷之功，是临床上治疗脾虚证的经典方剂。研究表明，补中益气汤可提高脾气虚动物模型免疫器官指数，有助于提高免疫功能[3]。

念珠菌感染容易并发多器官功能不全综合征，其中肝脏是重要的靶器官[10]。线粒体结构和功能的改变参与了脓毒症发生、发展的过程[11]。脓毒症早期，肝细胞线粒体即可出现结构和功能改变，是脓毒症发展的重要启动环节；脓毒症恢复期，线粒体损伤伴随着新的线粒体蛋白的生成，是参与脓毒症机体修复过程的重要表现[12]。

目前针对补中益气汤治疗脾虚动物模型的研究仅限于T淋巴细胞增殖能力和脾淋巴细胞抗氧化损伤[13]。本研究前期研究证实，免疫调节剂减轻念珠菌感染所致肝损伤与保持肝脏线粒体的完整性有关，但补中益气汤对念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护机制未明[14]。本研究中，试验组PGC-1α mRNA显著高于对照组，提示补中益气汤可以通过促进念珠菌感染动物模型肝细胞线粒体生成发挥对肝细胞线粒体的保护作用。既往研究证实，蛋白酶抑制剂可以提高PGC-1α水平，并且呈剂量依赖性，提示肝细胞线粒体生物发生参与了念珠菌感染病理损害的过程。

线粒体结构和功能损伤是脓毒症器官功能损害的重要机制，大量动物研究结果显示细胞因子的级联反应是线粒体结构和功能损伤的主要原因之一[15-16]。细胞因子风暴包括氧化应激和氮化应激。近来多项基础研究显示氮化应激参与了脓毒症线粒体结构和功能损伤的全过程[17-18]。本研究中，试验组氮化应激指标显著低于对照组，提示補中益气汤可以通过抑制氮化应激水平促进念珠菌感染动物模型肝细胞线粒体生物发生，降低氮化应激程度与肝细胞保护作用相关。补中益气汤与氮化应激、肝细胞线粒体生物发生之间的量效关系尚待进一步的探索研究。

[参考文献]

[1]朱丹婷，李景，俞立英.白色念珠菌致病性研究进展[J].中国真菌学杂志，2015，10（1）：54-58.

[2]杨璐，冯文莉.光动力疗法抗白色念珠菌感染的研究进展[J].中华临床医师杂志（电子版），2016，10（20）：3107-3111.endprint

[3]罗晶，顾红缨，徐国宪.补中益气汤对脾虚小鼠免疫功能的调节[J].中国现代医学杂志，2006，16（17）：2613-2615.

[4]邢文婷，张李峰，程卫东，等.含红芪和含黄芪的补中益气汤含药血清对老龄小鼠脾淋巴细胞抗氧化损伤作用的比较[J].中药材，2014，37（2）：299-302.

[5]刘春英，胡小萍，赵金茹，等.补中益气汤对感染白色念珠菌小鼠免疫功能调节作用的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，1997，3（2）：19-20.

[6]李小悦，黄顺伟，江智毅，等.乌司他丁对侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏的保护作用及机制研究[J].中国急救医学，2013， 33（10）942-944.

[7]李小悦.乌司他丁对侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护作用[J].中国当代医药，2016，23（15）：106-108.

[8]李小悦，黄顺伟，陈娟，等.乌司他丁联合抗真菌药物治疗侵袭性念珠菌感染的实验研究[J].中华普通外科学文献（电子版），2013，7（4）：21-24.

[9]Pfaller MA，Diekema DJ.Epidemiology of invasive candidiasis：a persistent public health problem[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：133-163.

[10]阿米娜·阿不拉，斯拉甫·艾白，古力娜·達吾提，等.鞣花酸体外抗真菌活性及对小鼠白色念珠菌感染模型的治疗作用研究[J].中国药理学通报，2016，32（3）：399-403.

[11]罗晶，顾红缨，徐国宪.补中益气汤对脾虚小鼠免疫功能的调节[J].中国现代医学杂志，2006，16（17）： 2613-2615.

[12]Singer M.Mitochondrial function in sepsis：acute phase versus multiple organ failure[J].Crit Care Med，2007，35（Supple）：S441-S448.

[13]Benton CR，Han XX，Febbraio M，et al.Inverse relationship between PGC-1 alpha protein expression and triacylglycerol accumulation in rodent skeletal muscle[J].J Appl Physiol，2006，101（2）：388-382.

[14]尹刚，王志强，肖莉.感染性休克肝细胞线粒体损伤机制的实验研究[J].中国急救医学，2003，23（10）：692-693.

[15]吕杰，杨劲松，李童，等.血必净注射液对脓毒性休克大鼠器官微观结构的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2015，22（1）：46-50.

[16]Sato K，Miyakawa K，Takeya M，et al.Immunohistochemical expression of inducible nitric oxide syntheses（iNOS）in reversible endotoxic shock studied by a novel monoclonal antibody against rat iNOS[J].J Leukoc Biol，1995，57（1）：36-44.

[17]钱建辉， 刘江伟， 李瑞，等.沙漠干热环境下创伤失血性休克大鼠肝脏组织形态学和肝脏功能的变化特点[J].中国急救医学，2014，34（7）：644-647.

[18]Bruins MJ，Lamers WH，Meijer AJ，et al.In vivo measurement of nitric oxide production in porcine gut，liver and muscle during hyperdynamic endotoxaemia[J].Br J Pharmacol，2002，137（8）：1225-1236.

（收稿日期：2017-11-02 本文编辑：崔建中）endprint