电针长强穴对FMR1基因敲除小鼠皮质区CREB蛋白表达的影响

张志灿，杨晓婷，林 栋

（福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122）

随着社会医疗的不断发展，近年来出现了许多关于智力落后、精神发育不全或精神发育迟滞等相关研究。精神发育迟滞多数发生于婴幼儿期，而脆性 X综合症（fragile x syndrome，FRX）是常见的遗传性智力发育迟缓疾病，其主要症状是神经突触发育的各种异常，如树突棘异常，突触之间的连接对于中枢神经系统的可塑性有重要作用［1-2］。实验研究表明，针刺长强穴可以改善自闭症模型大鼠学习和记忆能力，同时针灸治疗精神发育迟滞有着较好的临床疗效［3-4］。在针灸的作用机制研究中，有学者发现环磷酸腺苷反应原件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）具有调节神经元功能和结构的可塑性的作用［5］，CREB信号通路参与长时程的易化，使得学习记忆出现活动依赖性［6］。此外，CREB信号通路还参与了神经退行性疾病的发生发展过程［7］。结合课题组的前期工作，本研究采用脆性X智力低下1（fragile X mental retardation 1，FMR1）基因敲除小鼠，这种小鼠具有智力低下、焦虑烦躁及易被激惹的特点［8-9］。本论文通过观察该小鼠的自主行为学及皮质区CREB蛋白表达水平，探讨电针长强穴对FMR1基因敲除小鼠皮质功能的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 FMR1基因敲除型小鼠24只，由福建中医药大学实验动物中心提供。于19日龄对小鼠进行剪耳、分笼、取血并鉴定基因型。本研究动物在福建中医药大学实验动物中心按SPF级环境喂养。

1.2 实验试剂 免疫印迹一抗CREB，免疫印迹二抗 Goat Anti-Rabbit IgG（Cell Signaling Technology）；BCA法测定蛋白质浓度［生工生物工程（上海）股份有限公司］；显影液（MXB Biotechnologies）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.3 实验仪器 SW-CJ-ID洁净工作台（苏州江东精密仪器有限公司）；DC-1020型电热恒温水槽（上海平轩科学仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海谱振生物科技有限公司）；VE-180垂直电泳槽（上海郎赋实业有限公司）；GG／D2凝胶成像系统（Gene Genius公司）；HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪（北京华运安特科技有限责任公司）；RM2235切片机（徕卡微系统有限公司）；ZZ-6小鼠自主活动测试仪（上海欣曼科教设备有限公司）；凝胶成像分析仪（美国BIO-RAD公司）；TD4XD离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；华佗牌0.25 mm×3 mm毫针（苏州医疗用品厂有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组和干预 根据基因鉴定结果，将23日龄的小鼠随机分为空白组、电针非穴组、电针长强穴组各8只。选取华佗牌30号1寸毫针，长强穴组于尾根与肛门之间的凹陷中进针，进针方向沿小鼠尾根部下方向前直刺，进针深度约10 mm；电针非穴组于肋弓最低点上1 cm进针。2组均采用韩氏电针仪连接针灸针，刺激参数为2 Hz频率，连续波，强度为1～3 mA，以小鼠局部肌肉轻微抖动且无明显挣扎为度，持续时间20 min，进针及留针期间将小鼠以黑布蒙头，以双手适度束缚。空白组除模拟针刺过程中的抓取动作外，不进行其他操作。各组小鼠均连续干预14 d，于第15 d取材。

2.2 自主行为学检测 分别于干预前2天（T1）、干预结束前2天（T2）进行自主行为学检测。将3组小鼠依次放入自主活动测试仪中，适应环境5 min后开始启动机器，时间为10 min，检测后记录活动数及清算黑格里的粪便数。

2.3 皮质区CREB蛋白表达 取出FMR1基因敲除型小鼠的皮质脑区，采用Western blot印迹法检测CREB蛋白表达水平，用自动凝胶成像系统Chemi Imager 5500V2.03软件进行扫描，用Fluor Chen 2.0软件进行定量分析测得IDV值（integrated density value）。

2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0进行统计分析。计量资料符合正态分布以（）表示，采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 3组小鼠自主行为学情况比较 见表1。

表1 3组小鼠自主行为学情况比较（）

表1 3组小鼠自主行为学情况比较（）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与电针非穴组比较，2） P＜0.05。

组别空白组电针非穴组电针长强穴组n 8 8 8 T1 124.00±12.00 129.00±10.00 129.00±13.00活动量／次 粪便数／个T2 124.00±6.00 138.00±8.00 156.00±13.001）2）T1 4.38±1.60 4.44±1.27 4.19±1.07 T2 4.25±1.46 4.56±0.94 5.19±1.33

3.2 3组小鼠皮质区CREB蛋白表达的比较 见图 2、表 2。

图2 3组小鼠皮质区CREB蛋白电泳图

表2 3组小鼠皮质区CREB蛋白表达比较（）

表2 3组小鼠皮质区CREB蛋白表达比较（）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与电针非穴组比较，2） P＜0.05。

CREB／β-actin 1.82±1.90 2.41±1.85 5.76±3.511）2）组别空白组电针非穴组电针长强穴组n 8 8 8

4 讨论

《灵枢》记载：“督脉之别，名曰长强……入贯膐，实则脊强，虚则头痛。”［10］古人以长强穴作为治疗脑部疾病的重要穴位。在临床研究中发现，针灸长强穴能在一定程度上改善精神发育迟滞儿童的学习记忆能力。目前，长强穴已经被作为治疗精神发育迟滞、抑郁症等认知障碍疾病的治疗要穴。有研究显示电针能促进脑缺血损伤后神经递质的恢复，改善认知障碍，增强学习记忆能力［11］。也有研究显示电针承山与长强能起到一定的镇痛作用，可能与神经修复有关［12］。因此本研究探讨电针长强穴对FMR1基因敲除小鼠自主行为学及CREB蛋白的影响。实验结果表明，干预后电针长强组较其他组活动数明显增加，同时电针长强穴的FMR1基因敲除小鼠CREB蛋白表达增强，提示电针FMR1基因敲除小鼠的长强穴在某种程度上能够提高小鼠皮质运动系统的兴奋性而表现为活动数增加，而这一效应则有可能通过对CREB蛋白表达的提高得以实现。有研究发现电针改善AD小鼠重新恢复突触功能，最终提高AD小鼠学习记忆能力［13-16］。而突触的连接能够影响反射的感觉和运动神经元，其中CREB磷酸化对长时程易化过程起到至关重要的作用。因此，CREB蛋白表达的提高，对神经元的应激及再生有着关键的作用，并有可能通过与神经营养因子等相关信号分子的相互作用，对精神发育迟滞等疾病发挥作用。

综上所述，电针长强穴可以增加FMR1基因敲除小鼠的活动量及其皮质CREB蛋白的表达量，为我们后续开展针刺FMR1基因敲除小鼠长强穴对损伤神经元影响的机制探索提供实验数据。

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