电针后血清对脂多糖诱导的软骨细胞IL-1β、IL-6表达的影响

陈后煌 ，李西海，李 俐 ，吴追乐，郑春松 ，徐 欣，洪秀娥 ，吴明霞

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以软骨退变、软骨下骨重建失衡以及骨赘形成为主要特征的慢性骨关节疾病，病情反复，缠绵难愈［1-2］。作为软骨中唯一的细胞类型，软骨细胞对维持软骨的完整性及软骨的负重功能具有重要作用，软骨细胞功能改变是引起OA的重要因素。软骨退变的发病机制尚未完全阐明，但已有研究表明：炎症因子对骨关节炎软骨退变进程发挥重要调控作用［3-4］。电针具有舒筋通络、消肿止痛、补肾益精等作用，其特点为多层面、多途径、多靶点治疗，经过中枢的整合可有效调控机体的免疫应答以及细胞的增殖、分化及凋亡，从而减轻患者的临床症状［5-7］。电针能够有效改善关节软骨的炎性症状［8］，但其具体机制不甚明了。为探讨电针的作用机制，本实验采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导建立SD大鼠体外软骨细胞炎症模型，观察电针后血清对软骨细胞炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；华佗牌一次性不锈毫针，规格：15 mm×0.25 mm（苏州医疗用品厂有限公司）；IX70倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；LX-800酶标仪（美国BIO-TEK公司）。

1.2 实验动物 2月龄和4周龄清洁级雄性SD大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［合格证号：SCXK（沪）2012－0002］。 处理实验动物依据《关于善待实验动物的指导性意见》［9］。

1.3 实验药物 LPS购自美国sigma公司，用PBS缓冲液溶解，配置成10 μg／mL母液，4℃保存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 电针后血清的制备 2月龄雄性SD大鼠40 只，随机分为空白组（n＝10）和造模组（n＝30）。造模组采用改良 Hulth造模法复制膝骨关节炎模型，模型成功的判定标准参考文献［10］，术后4周，将造模成功的造模组大鼠随机分为对照组、实验1组和实验2组各10只。

实验组大鼠取双侧膝关节内、外膝眼，采用15 mm×0.25 mm毫针垂直刺入4 mm，调整电子针疗仪脉冲频率2 Hz，输出脉冲强度2 mA，每周治疗5 d，休息2 d，共治疗12周。实验1组每天电针治疗15 min，实验2组每天电针治疗30 min，空白组和对照组正常饲养。治疗时间按人和动物药物等效剂量换算：给药剂量＝临床常用量×动物等效面积系数，确定电针干预时间为15 min等效于临床30 min 的治疗时间［11－12］。 疗程结束后，水合氯醛麻醉，腹主动脉采集血液，制备实验用血清。

1.4.2 软骨细胞的分离、培养 4周龄SD大鼠10只脱颈处死，75%酒精浸泡5 min，无菌条件下分离双膝关节，切取关节表面软骨，修剪去除肌肉、骨膜和软骨下骨，以不渗血为度；切取软骨，置于无菌培养皿，用PBS缓冲液冲洗关节软骨3次，冲洗后加入2.5 g／L胰蛋白酶，37℃培养箱消化20 min，终止消化；置入盛有0.2%Ⅱ型胶原酶的培养皿，放于37℃培养箱中，每45 min取上清，用200目滤网过滤，收集滤液，1000 r／min离心 5 min，收集软骨细胞，并换消化液继续进行消化，重复4次。用DMEM完全培养液（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL、链霉素 100 μg／mL）重悬软骨细胞，调整软骨细胞悬液浓度为（2～3）×105／mL，接种于培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后首次换液，每2 d更换培养液1次，倒置显微镜下观察软骨细胞长满至80%后传代培养，此为原代软骨细胞，待细胞长满至培养瓶底90%左右时，可再次传代培养［13］。

1.4.3 软骨细胞分组和干预 第2代软骨细胞以1×105／mL密度接种于6孔板内，培养24 h后弃培养基，PBS清洗，将细胞分为正常组、模型组、电针15 min组和电针30 min组。正常组加入含10%空白组血清的培养液；模型组加入含10%空白组血清、10 ng／mL LPS的培养液；电针15 min组加入含实验1组血清、10 ng／mL LPS的培养液；电针30 min组加入含实验2组血清，10 ng／mL LPS的培养液。干预8 h后，ELISA法检测各组细胞培养液中IL-1β、IL-6 的含量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件处理数据。计量资料属正态分布以（）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。

2 实验结果

2.1 软骨细胞形态学观察 原代软骨细胞早期多呈多角形或三角形，1～3个核仁，大小和致密程度不等；培养3 d后可见软骨细胞逐渐增大，胞核与核仁也逐渐清晰（图1A）。第1代软骨细胞，以圆形或椭圆形为主，培养3 d可见细胞融合，出现成簇生长现象（图1B）。第2代软骨细胞增殖速度较快，形态结构一致，呈星形、多边形，胞浆丰富，胞核清晰，可见1～2个核仁，逐渐融合为单层，呈不规则“铺路石”样（图1C）。第3代软骨细胞增殖速度相对减慢，多出现脂肪粒样“老化”现象（图1D）。

图1 软骨细胞形态图（×200）

2.2 软骨细胞的Ⅱ型胶原免疫组化鉴定 Ⅱ型胶原免疫组化染色可见阳性细胞的胞浆呈棕黄色（图2A），未见棕黄色为阴性细胞（图2B）。

2.3 4组软骨细胞干预后IL-1β、IL-6表达变化比较 见图3。

3 讨论

3.1 软骨细胞的培养鉴定 软骨退变是骨关节炎的主要病理特征，表现为软骨细胞、软骨基质以及软骨下骨降解与合成偶联正常失衡。软骨细胞为关节软骨中唯一的细胞类型，利用机械和化学分离方法，通过原代培养和传代培养，可分离培养出纯度较高的软骨细胞［14］。软骨细胞无特异性标志物，通过对其分泌的主要基质成分Ⅱ型胶原免疫组化染色，结合取材部位和培养观察来鉴定，Ⅱ型胶原免疫组化显示软骨细胞胞质呈棕黄色，胞核不显色［15-17］。

图2 软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化鉴定图（×200）

图3 4组软骨细胞干预后IL-1β、IL－6表达变化图

3.2 体外诱导软骨细胞炎症模型 炎症介质是介导骨关节炎软骨退变的关键因素，在骨关节炎的病理进程中发挥重要的调控作用。细胞因子是一组多肽类细胞调节物质的总称，其中IL-1β、IL-6是骨关节炎病理过程中促进关节软骨破坏和软骨基质降解最主要的细胞因子。本实验采用LPS刺激体外大鼠软骨细胞模拟建立骨关节炎软骨细胞的炎症模型，在细胞水平研究骨关节炎的相关机制［18］。

3.3 电针后血清对软骨细胞炎症的影响 实验结果显示，电针后血清能够降低LPS诱导的软骨细胞上清液炎症因子IL-1β、IL-6的表达，提示电针治疗骨关节炎的可能分子机制是通过降低软骨细胞中异常升高的IL-1β和IL-6水平，减少机体炎症因子的释放，减轻炎症刺激，从而抑制软骨基质的降解，延缓软骨的退变和骨关节炎的进一步发展。

3.4 本研究的局限性及展望 本研究的不足之处在于检测的炎症指标只涉及最常见的炎症因子IL-1β和IL-6，其他相关炎症指标如TNF-α、MMPs等也有可能发生改变，并且对软骨细胞的形态、活性及功能产生影响；通过体内实验研究，如HE染色、免疫组化染色、电镜观察等，可以更为直观地观察电针对关节软骨炎症的影响；从相关信号通路及Micro-RNAs角度进一步探讨电针对软骨细胞炎症的影响，这都将是未来的研究方向。

［1］ 李西海，梁文娜，叶蕻芝，等.独活寄生汤调控风寒湿痹型骨关节炎软骨下骨重建失衡的作用机制探讨［J］.风湿病与关节炎，2014，3（8）：62-64，80.

［2］ 陈后煌，邵翔，马玉环，等.骨关节炎骨赘形成的机制探讨［J］.风湿病与关节炎，2016，5（5）：36-38.

［3］ KROMAN S L，ROOS E M，BENNELL K L，et al.Measurement properties of performance-based outcome measures to assess physical function in young and middle-aged people known to be at high risk of hip and／or knee osteoarthritis：a systematic review ［J］.Osteoarthritis Cartilage，2014，22（1）：26-39.

［4］ LI C，CAI H，MENG Q，et al.IL-1β mediating high mobility group box protein-1 expression in condylar chondrocyte during temporomandibular joint inflammation ［J］.J Oral Pathol Med，2016，45（7）：539-545.

［5］ WU M X，LI X H，LIN M N，et al.Clinical study on the treatment of knee osteoarthritis of Shen-Sui insufficiency syndrome type by electroacupuncture ［J］.Chin J Integr Med，2010，16（4）：291-297.

［6］ PLASTER R，VIEIRA W B，ALENCAR F A，et al.Immediate effects of electroacupuncture and manual acupuncture on pain，mobility and muscle strength in patients with knee osteoarthritis：a randomised controlled trial ［J］.Acupunct Med，2014，32（3）：236-241.

［7］ 吴广文，郑春松，李西海，等.电针对实验性膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡及软骨基质的影响［J］.康复学报，2017，27（5）：22-28.

［8］ LI J，LI J，CHEN R，et al.Targeting NF-κB and TNF-α activation by electroacupuncture to suppress collagen-induced rheumatoid arthritis in model rats ［J］.Altern Ther Health Med，2015，21（4）：26-34.

［9］ 中华人民共和国科学技术部.关于发布《关于善待实验动物的指导性意见》的通知［J］.畜牧兽医科技信息，2007（4）：35-36.

［10］刘献祥，李西海，周江涛.改良Hulth造模法复制膝骨性关节炎的实验研究［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（12）：1104-1108.

［11］吴明霞，李西海，李俐，等.电针后血清对TNF-α诱导凋亡软骨细胞 MAPK 信号通路的影响［J］.福建中医药，2011，42（6）：43-45.

［12］吴明霞，李西海，吴广文，等.电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（46）：8551-8555.

［13］叶锦霞，吴广文，李西海，等.透骨消痛胶囊对凋亡软骨细胞Rac1和Cdc42表达的影响［J］.中国组织工程研究，2014，18（42）：6747-6751.

［14］ FRONDOZA C G，HEINECKE L F，GRZANNA M W，et al.Modulation of cytokine-induced prostaglandin E2production in cultures of articular chondrocytes obtained from carpal joints of camels （Camelus dromedarius） ［J］.Am J Vet Res，2011，72（1）：51-58.

［15］ LIN P，WENG X，LIU F，et al.Bushen Zhuangjin decoction inhibits TM-induced chondrocyte apoptosis mediated by endoplasmic reticulum stress ［J］.Int J Mol Med，2015，36（6）：1519-1528.

［16］ LIU F，LIU G，LIANG W，et al.Duhuo Jisheng decoction treatment inhibits the sodium nitroprussiate-induced apoptosis of chondrocytes through the mitochondrial-dependent signaling pathway ［J］.Int J Mol Med，2014，34（6）：1573-1580.

［17］ WENG X，LIN P，LIU F，et al.Achyranthes bidentata polysaccharides activate the Wnt／β-catenin signaling pathway to promote chondrocyte proliferation ［J］.Int J Mol Med，2014，34（4）：1045-1050.

［18］ WANG Y，ZHANG J J，YANG W R，et al.Lipopolysaccharideinduced expression of FAS ligand in cultured immature boar sertoli cells through the regulation of pro-inflammatory cytokines and miR-187 ［J］.Mol Reprod Dev，2015，82（11）：880-891.