清眩降压汤对离体大鼠胸主动脉的舒张作用及黄芩苷成分分析

林 珊 ，张 铃 ，蔡巧燕 ，王 怀 ，陈宏伟 ，彭 军 ，褚剑锋

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学陈可冀学术思想传承工作室，福建 福州 350122）

清眩降压汤是治疗高血压、缺血性脑血管病、眩晕等疾病的临床经验方，具有平肝潜阳、息风、清肝热、益肝肾等作用，对临床上高血压病所致的眩晕、耳鸣、失眠、头痛等症状均有疗效［1-3］。清眩降压汤由天麻、钩藤和黄芩等十多味中药组成，主要成分为天麻素、钩藤碱和黄芩苷等生物活性物质。研究表明，清眩降压汤能降低自发性高血压大鼠的动脉血压，同时降低NO水平，减轻高血压的脑部损害过程；对心肌重构、肾脏纤维化和血管重构等靶器官的损害均有保护作用，进一步对逆转血管重构表现出明显作用［4-9］，但对清眩降压汤治疗高血压有效成分的分析及其对主动脉血管环的作用未见报道。本文通过离体大鼠胸主动脉血管环实验，探究清眩降压汤对血管环的保护作用，并运用超高液相色谱仪分析其主要成分黄芩苷，为清眩降压汤治疗高血压的临床研究提供实验数据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 健康SPF级雄性Wistar大鼠，体

质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（许可证号：SCXK（沪）2012-0002）。 置SPF级实验室中正常喂养，恒温、恒湿、12 h光照／天，适应性喂养1周后，进行后续试验。

1.2 实验药物 清眩降压汤生药材购于福建中医药大学附属第三人民医院。黄芩苷（B20570 CAS#21967-41-9）购自上海源叶生物科技有限公司，纯度经UPLC-DAD（面积归一法）检测含量均大于98.0%。

1.3 实验试剂 戊巴比妥钠（上海化学试剂进出口公司）；重酒石酸去甲肾上腺素（NE，美国Sigma公司）；乙腈、甲醇（德国MERCK公司）。K-H缓冲液（1L）由 NaCl 115.0 g，KCl 4.7 g，CaCl222.5 g，MgCl21.2 g，NaHCO325.0 g，KH2PO41.2 g 和葡萄糖10.0 g配制而成。

1.4 实验仪器 Angilent 1290超高液相色谱仪（德国安捷伦公司）；HV1403离体组织器官恒温灌流系统（成都泰盟科技有限公司）；JH-2肌张力换能器（北京航天医学工程研究所）；BL-420S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；HW-500型超级恒温水浴（成都泰盟科技有限公司）；AR2130电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；CP225D电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ-300DB台式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 药物制备 取清眩降压汤复方药材210 g，加入10倍量水浸泡0.5 h，水煎煮 1 h，共提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至稠膏，减压干燥10 h，粉碎，即得清眩降压汤粉末。药物最终配置成1 mg／mL，稀释后进行实验。

2.2 大鼠胸主动脉环制备 取Wistar大鼠，予2%戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉采血处死，迅速开胸分离胸主动脉，置于4℃含95%O2和5%CO2的预饱和K-H缓冲液中，固定血管环两端，剔净血管周围的脂肪组织及结缔组织，剪成长度3～4 mm的血管环。取2根不锈钢微型三角挂钩从血管环管腔穿过后固定，水平悬挂于20 mL浴漕内，连接张力转换器，使用BL-420S生物机能实验系统记录血管环的张力。浴漕内持续通入95%O2和5%CO2，缓慢调节血管环张力至2 g，37℃下稳定1 h，期间每隔20 min换液一次。

2.3 对血管环的直接作用 取大鼠胸主动脉血管环，随机分为对照组和清眩降压汤组。清眩降压汤组采用累积加药法每隔 30 min加入药物，使浴槽内药物的浓度递增达到 0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL和1 mg／mL，对照组加入等量的生理盐水。同时，记录血管环张力值的变化情况，观察清眩降压汤对血管环张力的影响。

2.4 对NE预收缩血管环张力的影响 取大鼠胸主动脉血管环，随机分为对照组和清眩降压汤组。对照组和清眩降压汤组用1×10-6mol／L重酒石酸去甲肾上腺素（NE）预收缩血管环达稳定后，清眩降压汤采取累积加药法，每隔30 min加入药物，使浴槽内药物的浓度递增达到 0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL和 1 mg／mL，对照组加入等量的生理盐水。同时，记录血管环张力值的变化情况，观察清眩降压汤对 NE（1×10-6mol／L）预收缩的胸主动脉环张力的影响。

2.5 UPLC分析清眩降压汤的成分

2.5.1 对照品溶液的制备 精密称定黄芩苷对照品适量，加入100%甲醇制备得到浓度为0.05 mg／mL的单一对照品储备液。

2.5.2 供试品溶液的制备 称取清眩降压汤粉末0.2 g，置于具塞三角瓶中，并精密加入100%甲醇10.00 mL，称重，超声提取 20 min，放冷，再称重，用100%甲醇补重后摇匀，取其上清液，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5.3 色谱条件 Acclaim UPLC RSLC 120 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（B）梯度洗脱，进样量 2 μL，流速 0.400 mL／min，柱温 30℃，检测波长 280 nm。

2.5.4 成分分析 取黄芩苷对照品溶液，以吸收峰的峰面积对含量作线性回归。取清眩降压汤样品，分别按“2.5.2项”下制备供试品溶液，按“2.5.3项”下色谱条件，进样量2 μL，并记录其色谱峰的峰面积积分值，通过线性回归方程计算清眩降压汤中黄芩苷的含量。

2.6 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料符合正态分布以（）表示，采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 清眩降压汤对胸主动脉血管环收缩的影响清眩降压汤对血管环的张力并无明显改变，与对照组比较无显著差异，结果表明，清眩降压汤对胸主动脉血管环的静息张力不具影响，结果见图1。

3.2 清眩降压汤对NE预收缩血管环张力的影响加入 NE（1×10-6mol／L）预收缩血管环后，累计加入清眩降压汤可引起血管环浓度依赖性舒张。清眩降压汤对NE引起的血管收缩具有一定的舒张作用，与对照组比较，具有显著性差异（P＜0.05），且浓度越高，舒张作用越明显，存在量效关系。在NE体系下，清眩降压汤对血管的最大舒张力达（88.35±2.21）%，结果见图 2。

图1 清眩降压汤对静息状态下血管环张力的影响（n＝6）

图2 清眩降压汤对NE预收缩血管环张力的影响（n＝6）

3.3 清眩降压汤成分分析及黄芩苷含量测定 黄芩苷的峰面积积分值与进样量之间关系的回归方程为 Y＝11736X＋33.196（R2＝0.999），说明黄芩苷标准品的浓度在0.01～0.1 mg／mL之间能呈良好的线性关系。如图3所示，A、B分别为黄芩苷及清眩降压汤的UPLC色谱图。结果显示，清眩降压汤与黄芩苷标准品均在同一时间出峰，表明清眩降压汤中含有黄芩苷。且与其他色谱峰比较，黄芩苷的相对峰面积最高，是清眩降压汤中最主要化学成分。经黄芩苷标准曲线回归方程计算，清眩降压汤中黄芩苷的含量为0.83 mg／g。结果见图3和表1。

图3 标准品及清眩降压汤的UPLC色谱图

表1 清眩降压汤的黄芩苷含量测定

4 讨论

高血压在我国患病率高，已经成为我国数量大的重大慢性疾病之一［10-12］。研究数据表明，血压的增高，会导致主动脉僵硬度和体质量指数的增加，而主动脉的张力、膨胀性、僵硬度指数的增加又可作为预测收缩压、舒张压和脉压增高的指标，因此主动脉僵硬度增加是预示血压增高的重要决定因素［13］。长期的压力负荷过大可引起血管壁张力持续增高，一方面引起主动脉发生外向肥厚性重构；另一方面可导致各种细胞因子变化，从而引起血管舒张功能异常。大动脉是血液流通的主要管道，其管壁肥厚会导致血管的扩张性下降、僵硬度增加，最终影响血管的正常功能［14］。因此，舒张血管、改善高血压进程中大动脉的损伤程度及修复血管情况是评价抗高血压药物的主要疗效指标之一［15－16］。

清眩降压汤是陈可冀院士60余年临床工作中治疗高血压的验方，临床研究中表明治疗高血压疗效确切，前期基础实验发现清眩降压汤能显著抑制自发性高血压大鼠血压升高和保护靶器官［5-8］。黄芩是传统中医用药，对温热病、高血压等病具有治疗效果，黄芩主要含黄芩苷等黄酮类化合物。在前期预实验工作中，我们在实验摸索中发现，黄芩苷可作为清眩降压汤中的指标成分，其响应值最大，成分分析时色谱峰非常明显，实验结果图3与预实验结果一致。清眩降压汤的成分分析中，结果表明黄芩苷为最主要成分之一。有研究报道，黄芩苷对NE和KCl引起的去内皮和内皮完整大鼠胸主动脉环的收缩均有舒张作用［17－18］。 本研究结果显示，清眩降压汤能显著舒张NE诱导内皮完整大鼠胸主动脉血管环的收缩，黄芩苷为清眩降压汤治疗高血压的主要有效成分之一。

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