缩泉固尿方对压力性尿失禁模型大鼠TGFβ-3表达的干预研究

苑述刚，聂露霞，马少丹，廖水亨，南丽红，阮时宝

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是尿失禁最常见的类型，临床多以咳嗽、喷嚏、大笑、锻炼等腹压突然增加时出现尿液自尿道口流出为表现，其过程不伴逼尿肌收缩。严重者在日常活动时也会出现，严重影响患者的生活质量和身心健康［1］。据报道，我国成年女性SUI的发病率约在10%～40%，绝经后女性为本病的高发人群，可达30%左右［2］。随着人口老龄化的进程加快，SUI的发病率也呈现逐步上升趋势。现代医学对于中、重度SUI患者多采用手术疗法，轻、中度多用药物、盆底肌肉锻炼等，然较多的不良反应及后遗症限制了其应用［3-4］。中医对尿失禁的治疗手段也很多，已见报道的治疗方法主要有复方加减、针灸、针药结合以及推拿按摩等，疗效显著，副作用少，且远期疗效较稳定，已展示了良好的前景。本研究通过观察缩泉固尿方对SUI模型大鼠阴道前壁和肛提肌中转化生长因子β-3（transforming growth factor β-3，TGFβ-3）mRNA表达的影响，探索其作用机制。

1 实验材料

1.1 实验仪器 凝胶成像仪、水平电泳仪、基因扩增仪（美国Bio-Rad公司）；5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2 实验试剂与药物 Trizol（RNA提取试剂盒）、cDNA一链合成试剂盒（逆转录试剂盒）、PCR Mix（PCR聚合酶）、DNA maker、核酸染液均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；TAE（50×）缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司。

缩泉固尿方由熟地、西洋参、黄芪、桑螵蛸、补骨脂等中药组成，购于福建中医药大学国医堂，经鉴定均符合2015版《中华人民共和国药典》［5］相关规定。依据缩泉固尿方临床常用药物比例，水煎2次，过滤浓缩，4℃冰箱保存，备用。盐酸米多君（国药集团川药有限公司，生产批号：160301）

1.3 实验动物 由福建中医药大学实验动物中心（使用合格证：SYXK（闽）2014-005）提供的清洁级SD大鼠雌性74只，雄性16只，鼠龄约6周，体重约240～300 g。随机数字表法选取雌鼠64只以4∶1比例与雄鼠合笼，常规饲养至30 d左右分娩。

2 实验方法

2.1 分组及给药 将分娩后SD大鼠行阴道扩张（2次）＋卵巢切除法复制SUI模型，建模1个月后以尿流动力学验证模型成功与否，经检验64只大鼠建模成功54只。将模型成功大鼠随机分为5组，阳性对照组10只，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组每组各11只，将未分娩的10只雌鼠设为正常对照组，共6组。分组后进行药物干预，低、中、高剂量组每日按 5.7、11.4、22.8 g（kg·d）予缩泉固尿方药液灌胃，阳性对照组予相应剂量盐酸米多君灌胃，正常对照组、模型组均予等量生理盐水灌胃，连续给药1个月。

2.2 尿动力学检测 造模结束1个月后，禁食12 h，常规麻醉后仰卧位固定SD大鼠。尿道口消毒液消毒，将硬膜外导管涂上润滑剂经尿道置入膀胱约3.5 cm，并将三通管一端与尿动力学检测仪相连，再将微量输液泵也连于三通管。管道内充满无菌生理盐水排出空气。

2.2.1 最大膀胱容量检测 大鼠排空膀胱后，将无菌生理盐水通过微量输液泵以0.3 mL／min的速度注入膀胱，注入的同时校零尿动力学检测仪并检测。以尿道口刚开始出现液体的用时时间乘以速度算出最大膀胱容量，每只大鼠检测3次，取其平均值。

2.2.2 腹漏尿点压 大鼠排空膀胱后，向膀胱内注入1／2最大膀胱容量的无菌生理盐水。用手指由轻到重按压大鼠上腹部，使腹压逐渐上升以模拟 Valsalva动作，按压的同时校零尿动力学检测仪并检测，见液体自尿道口流出后停止按压，此时仪器显示膀胱内压即为腹漏尿点压（abdominal leak point pressures,ALPP），每只大鼠检测3次，取其平均值。

2.3 RT-PCR检测大鼠阴道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA 的表达

2.3.1 标本的取材 大鼠于末次给药后，禁食不禁水12 h，常规麻醉后迅速取出阴道前壁和肛提肌。用预冷的生理盐水洗去血渍，滤纸吸干水分后放入冻存管于液氮中速冻，-80℃冰箱保存，待提RNA。

2.3.2 总RNA抽提 取出冻存组织置于1.5 mL EP管内，加入200 μL的Trizol，并用手术剪将组织剪碎后用组织破碎仪进行破碎，再往管内加入800 μL的Trizol溶液，混匀后室温静置20 min。每1 mL Trizol中加200 μL的氯仿，用力摇晃混匀后室温静置10 min。再4℃高速离心机12 000 r／m离心15 min让其分层，RNA位于上层水相中，小心移出上层水相0.4 mL左右至另一无RNA酶的1.5 mL EP管中，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA提取。

2.3.3 逆转录（RT）反应 按下列组分配制DNA去除反应液：4×gDNA wiper Mix：4 μL，Total RNA：1 μg （根据各个样浓度加样），RNase Free dH2O：up to 16 μL，以上反应液振荡混匀，短暂离心，42℃2 min。按下列组分配制RT反应液：5×qRT SuperMix Ⅱ：4 μL，第一步反应液：16 μL，以上混合液振荡混匀，短暂离心，50℃孵育30 min，85℃孵育5 min，得到的cDNA溶液用于PCR反应。

2.3.4 PCR反应 ① 引物设计与合成：参照NCBI目的基因，设计TGFβ-3上下游引物，内参照基因为GAPDH。TGFβ-3上游引物为5'-TCCGTTTCAA TGTGTCCTCAG-3'，下游引物为 5'－GCTGCTTGGCTATGTGTTCA-3'，扩增片段为160 bp。GAPDH上游引物为 5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游引物为5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'，扩增片段为107bp。② RT-PCR反应体系：2×rTaq PCR Mix10 μL，上游引物（10 μM） 0.8 μL，下游引物（10 μM）0.8 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 加至20 μL。③PCR反应体系按以下程序进行扩增，预变性：94 ℃（5 min）；变性：94 ℃（30 s）；退火：58 ℃（30 s）；延伸：72 ℃（20 s），30 个循环；延伸：72 ℃（7 min）。反应完成后将扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像分析系统进行观察并拍摄电泳图像，分析各电泳条带之IOD值，以GAPDH作为内参，进行PCR产物的半定量分析，比值表示其相对含量。

2.5 统计学方法 使用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（）表示，采用单因素方差分析。

3 结 果

表1 6组大鼠给药前后ALPP值比较（）cmH2O

表1 6组大鼠给药前后ALPP值比较（）cmH2O

注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正常对照组模型组阳性对照组低剂量组中剂量组高剂量组给药前70.23±1.82 43.42±2.101）43.69±1.911）44.53±1.691）43.98±1.411）44.14±1.361）给药后69.79±2.80 44.27±1.261）55.13±1.382）48.40±2.012）54.77±1.952）62.75±1.462）

图1 缩泉固尿方对SUI模型大鼠阴道前壁中TGFβ-3 mRNA表达的影响

图2 缩泉固尿方对SUI模型大鼠肛提肌中TGFβ-3 mRNA表达的影响

4 讨 论

SUI的发病机制一直未有定论，最早提出的是尿道支持解剖学障碍，并认为“压力传导理论”是其发生过程；后有研究发现年龄增大和盆底手术造成尿道括约肌功能不良也可引发SUI。随着研究不断深入，单一的解剖学和功能学机制解释已无法被认同，所以分子生物学的深入研究成为新方向。TGFβ-3被认为是机体创伤后参与修复过程最重要的生长因子之一，是 TGFβ家族亚型之一［6］。研究表明TGFβ-3能促进胶原等间质蛋白质的合成，又可通过抑制细胞外基质蛋白酶及刺激其抑制剂的合成而使胶原的降解减慢，通过对胶原蛋白的促进合成和抑制降解双向调节作用来增加肌肉组织弹性［7］。目前普遍认为尿道支撑结构的功能异常是SUI的主要发生原因，所以设想分娩损伤或衰老后盆底组织中的TGFβ-3有所下降，使组织的胶原蛋白合成减弱或消失，肌肉弹性降低，肌力支撑不够而发生SUI。张莹安等［8］研究发现SUI模型大鼠阴道前壁及肛提肌中TGFβ-3 mRNA含量较正常组明显降低。

表2 6组大鼠阴道前壁、肛提肌中TGF-β3 mRNA的表达（）

表2 6组大鼠阴道前壁、肛提肌中TGF-β3 mRNA的表达（）

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

动物数／n 10 11 10 11 11 11组别正常对照组模型组阳性对照组低剂量组中剂量组高剂量组给药剂量 ／（g／kg）——0.0015 5.7 11.4 22.8阴道前壁1.539±0.179 0.824±0.1711）1.096±0.1153）0.884±0.133 0.942±0.1252）1.199±0.1163）肛提肌1.561±0.085 0.745±0.1021）0.879±0.1582）0.805±0.121 0.863±0.1032）0.914±0.1393）

传统中医多将SUI归属中医“小便不禁”“膀胱咳”“遗尿”等范畴，临床主要表现为小便排出异常，并认为其病因病机与“气”密切相关，而气的生理功能主要依赖于脾肾二脏［9］。缩泉固尿方系我国现代著名中医药学家俞长荣教授治疗尿失禁五十多年的经验效方。俞老认为，本病主要病因病机的形成与肺脾肾不足，气摄无权，膀胱失约，开阖失常有关。气有固摄之功，对人体津液有固护统摄和控制功能，若气虚不摄津，则致小便失禁。另外，肾与膀胱相表里，肾的封藏、固摄、温煦、气化作用直接影响膀胱对人体尿液的贮藏与排泄功能。本病以肺脾肾亏虚、气失固摄为本，膀胱失约为标，法当标本同治。宗法随证立、方从法出之则，缩泉固尿方由黄芪、补骨脂、西洋参、桑螵蛸、益智仁、熟地、甘草等中药组成，具有补脾益肾，固孚缩尿之功。

本实验通过对各组实验大鼠阴道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA表达的分析，结果表明SUI模型鼠中阴道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA的表达均低于正常对照组，缩泉固尿方中、高剂量组较模型组 TGFβ-3 mRNA 表达明显升高（P＜0.01）。证实TGFβ-3与SUI的发生具有相关性，而缩泉固尿方可能通过提高SUI模型鼠中阴道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA的表达对SUI产生治疗作用，是其可能的作用机制之一。

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