p16、DAPK和APC基因甲基化在肺癌早期诊断中的价值▲

骆江龙 李 鲲 冯 旭

(广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021)

当今世界肺癌的发病率仍然高居不下，文献[1]显示肺癌发病率在恶性肿瘤中已处于第一的位置，并且男性和女性的发病率都处于首位。发展中国家和发达国家也没有因为医疗环境的差异而有所变化，死亡率可能不一样，发病率大致差不多。预计到未来10年，肺癌在全世界仍将是新发病例数和死亡人数最多的恶性肿瘤。目前肺癌的治疗手段有很多种，包括常规的手术治疗和放化疗，近期的生物靶向治疗也有所进展。早期肺癌采取常规手术治疗一般可起到根治的效果。但当前肺癌治疗效果较差，难以达到预期效果，这主要归因于早期肺癌并无明显症状，且早期筛查手段诊断率不高，大部分在医院就诊的肺癌患者已发展到中晚期阶段，并且晚期肺癌并没有效果明显的治疗手段[1]。

肺癌的常规诊断技术是CT和X线等影像学手段，但是这些诊疗技术不利于鉴别肺癌的早期情况。近年来表观遗传学的发展，让我们可以将视角转向分子和基因检测等层面。早期检测和鉴别患者基因分子的变化情况，可能将是未来早期诊断肺癌的有力手段。有证据表明[2]抑癌基因的异常甲基化是导致基因失活的一个重要机制。本实验利用甲基化特异性PCR法分别检测肺癌、肺良性病变患者血浆中p16、DAPK和APC基因的甲基化情况，分析启动子DNA甲基化介导的基因在肺癌中的沉默以及具有潜在危险因素的无癌症对照可能为肺癌的预测提供线索。现报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选择2015年6月至2016年10月在广西医科大学第一附属医院就诊，行手术治疗且术后经本院病理科检测确诊为非小细胞肺癌的患者79例为研究对象，其中男57例，女22例，年龄35～80岁，中位年龄63.27岁。按2015版WHO肺癌组织学分类标准[3]：鳞癌37例，腺癌40例。按国际抗癌联盟肺癌TNM分期标准[4]：Ⅰ、Ⅱ期29例，Ⅲ、Ⅳ期50例。有淋巴结转移的32例，无淋巴结转移的47例。患者均排除其他恶性肿瘤病史且未行化疗或放疗等其他治疗。同时选择广西医科大学第一附属医院呼吸内科同年住院治疗的40例肺部非恶性肿瘤患者为对照组，其中男28例，女12例，年龄19～78岁，中位年龄57.23岁。对照组均排除肺部或其他器官的恶性肿瘤病史，其中支气管扩张16例，支气管肺炎9例，慢性阻塞性肺疾病(COPD)5例，肺结核4例，支气管哮喘、特发性间质性肺炎、自发性气胸、胸腔积液、炎性假瘤及肺囊肿各1例。病例资料的收集均征得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 患者均于治疗前抽取清晨空腹外周静脉血2 mL，ACD抗凝，2 000 r/min离心15 min分离血浆，再以12 000 r/min离心15 min，获得无血细胞成分的血浆，以1.5 mL试管分装，于-80℃保存待检测。

1.2.2 血浆DNA提取 采用天根生物科技有限公司(北京)的血液组织细胞基因组提取试剂盒，分别对肺癌组和对照组进行基因组DNA提取，提取过程按照试剂盒说明操作。采用紫外线分光光度计测定纯度和含量来判断提取结果。

1.2.3 亚硫酸氢钠修饰 采用Epigentek公司的Methylamp Universal Methylated DNA Kit试剂盒进行基因甲基化修饰，具体操作步骤按说明书。

1.2.4 MSP 参照文献[5-6]设计p16基因、DAPK基因和APC基因引物，分别识别甲基化特异性序列(M) 和非甲基化特异性序列(U)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及MSP反应条件见表1。PCR设计流程同文献[5]。

1.3 甲基化判定标准 PCR产物出现甲基化条带的样品，判定为基因甲基化；出现未甲基化条带，而不出现甲基化条带的样品，判定为基因未甲基化；甲基化条带和未甲基化条带均出现的样品，也判定为基因甲基化。

表1 MSP所用的引物序列及产物片断长度

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)；灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)；阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)；阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)[7]。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DNA甲基化检测结果 p16、DAPK和APC基因启动子甲基化结果见图1～图3。肺癌组外周血标本中p16、DAPK和APC基因启动子甲基化率分别为51.9%(41/79)、50.6%(40/79)、35.4%(28/79)，对照组患者外周血标本中p16、DAPK和APC基因启动子甲基化率分别为2.5%(1/40)、5.0%(2/40)、2.5%(1/40)，差异均有统计学意义(P<0.05)。MSP电泳结果见图1～图3。

图1 p16基因MSP产物凝胶电泳图。Marker：DNA marker；M：甲基化条带；U：未甲基化条带；P1：甲基化阳性对照；P2：甲基化阴性对照；1-3：肺癌组织；4：空白对照。

图2 DAPK基因MSP产物凝胶电泳图。Marker：DNA marker； M：甲基化条带；U：未甲基化条带；P1：甲基化阳性对照；P2：甲基化阴性对照；1：空白对照；2-4：肺癌组织。

图3 APC基因MSP产物凝胶电泳图。Marker：DN A marker；M：甲基化条带；U：未甲基化条带；P1甲基化阳性对照；P2：甲基化阴性对照；1-3：肺癌组织；4：空白对照。

2.2 p16、DAPK和APC基因甲基化与临床资料的分析 79例肺癌患者外周血中p16、DAPK和APC基因甲基化状态与临床资料的比较分析结果见表2。3个基因的甲基化率与肺癌患者性别、年龄、吸烟史、组织学类型、肿瘤分期和淋巴结转移等多项临床特征方面均无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 外周血p16、DAPK和APC基因甲基化水平与肺癌患者临床特征之间的关系

2.3 p16、DAPK和APC基因甲基化测定对肺癌的诊断效果 外周血p16、DAPK和APC基因甲基化的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值结果见表3。单个基因甲基化的灵敏度p16和DAPK基因相对更高、分别为51.9%、50.6%，APC基因比前两者较低，为35.4%。但是3个基因的特异度差别不大，分别为97.5%、95.5%、97.5%。多个基因的联合检测肺癌可明显提高灵敏度(73.4%)，但特异度有所下降(90%)。

表3 外周血p16、DAPK、APC基因甲基化的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值 (%)

3 讨 论

当前肿瘤临床诊断研究的热点主要在基因和蛋白两个方面，通过血清学检测基因和蛋白可初步鉴别肿瘤，但是大多数指标的准确率相对较低[8]，并且肿瘤的发展过程与多个因素有关，因此发现一个或者多个与肿瘤关系最密切的因子，对于恶性肿瘤的早期诊断和早期筛查具有显著的指导作用。

p16基因定位于人类染色体9p21，由2个内含子及3个外显子组成。P16蛋白是p16基因编码的细胞周期抑制性蛋白，可调节细胞的分裂和增殖。Yan等[9]荟萃分析表明p16基因在肺癌患者中发生甲基化现象非常普遍，基因的甲基化发生在肺癌形成早期阶段，并且具有高度的特异性和低度的敏感性。彭再梅等[10]研究表明p16基因的异常甲基化与患者的临床特征无相关性。本实验佐证了p16基因甲基化现象在肺癌早期就已经出现，有望成为肺癌早期诊断的指标之一。

DAPK基因定位于人类染色体 9q34.1，可参与调控多种细胞生理过程，与恶性肿瘤发生、发展、转移密切相关[11]。Tang等[12]研究发现，相比于未甲基化的肺癌患者，DAPK基因异常甲基化显著降低了肺癌患者的5年存活率。国外研究显示，DAPK可能是克服对抗EGFR药物抗性以提高治疗效果的新靶点，DAPK甲基化有作为药物反应的潜在生物标志物的可能[13-14]。本研究也显示了DAPK基因异常甲基化和肺癌的相关性。

APC基因位于人类染色体5q21，含21个外显子，该基因有控制细胞的死亡或成长的功能，可以有效控制细胞的数量。Schneikert等[15]研究表明，APC基因启动子异常甲基化不仅仅是肺癌患者的孤立现象，还出现在其他肿瘤，如结直肠癌、子宫内膜癌等。Feng等[16]的研究表明，APC基因启动子甲基化与肿瘤患者临床特征有关联的主要是肿瘤分期、淋巴结转移和吸烟；而本研究中APC基因甲基化与性别、年龄、吸烟史、组织学类型、肿瘤分期和淋巴结转移等临床资料均无相关性，这可能与研究中样本和研究方法的差异有关。Huang等[17]对151项研究行荟萃分析提示，APC基因是鉴别鳞癌和腺癌的一个重要指标。本研究未发现APC基因甲基化在鳞癌和腺癌之间的差异，也许需要进一步的研究。

本研究中，对肺癌患者血浆中3个基因的甲基化检测结果发现，单个检测结果灵敏度分别为51.9%(41/79)、50.6%(40/79)、35.4%(28/79)，双项联合检测灵敏度为62.0%(49/79)、69.3%(50/79)、59.5%(47/79)，三项联合检测灵敏度为73.4%(58/79)，随着检测项目的增多，联合检测可明显提高灵敏度，但是特异度却有所下降。这表明多个项目联合检测可有助于患者门诊的筛查。

综上所述，p16、DAPKA和APC基因启动子的异常甲基化伴随着肺癌的产生和发展，在肺癌的早期阶段均已出现，都有望成为肺癌早期诊断的指标。值得注意的是，肺良性疾患组中均出现了p16、DAPK和APC基因的异常甲基化，是否是肺癌发生的预兆，这需要下一步的研究证明。今后，我们将找寻更多的可以在肺癌诊断中发挥作用的因子，并对比各因子的检测费用和准确率，从中选出最好的并且适合推广的常规检测手段。

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