Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血中的表达及临床意义

陈国飞，杨华，蒋幸新，王波，徐艳

（1.江苏省苏州市中西医结合医院 检验科，江苏 苏州 215000；2.江苏省苏州市中西医结合医院 内四科，江苏 苏州 215000；3.江苏省苏州市吴中人民医院 内科，江苏 苏州 215128）

胃癌是世界上最为普遍的恶性肿瘤之一，在全球范围内，每年约有70万人死于胃癌，位居所有肿瘤的第2位[1]。在我国胃癌发病率远高于西方国家，是我国发病率第2高的恶性肿瘤，死亡率也高居第3位[2-3]。胃癌患者预后较差，大部分患者初次就诊时肿瘤已处于晚期或发生转移[3]。因此，胃癌的5年生存率仅为40%左右，其中大约5%的胃癌患者发生远处器官转移[4-6]。近年来，随着诊治水平的提高，胃癌的发病率在全球范围内逐步下降，但如何提高胃癌的早期诊断率及改善胃癌患者的术后生活质量仍是全球性的科研难点和热点。

Survivin是近年来发现的凋亡蛋白抑制分子，在多种恶性肿瘤中广泛表达，与肿瘤的恶性表型及不良预后密切相关[7-8]。CK19片段CYFRA 21-1也被证实是乳腺癌[9]、非小细胞肺癌[10-11]和结肠癌[11]等多种肿瘤的血清诊断标志物。但胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的诊断和预后价值目前尚未得到充分研究。本研究拟通过RT-PCR检测胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达水平，并联合分析Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌早期诊断和判断预后中的临床意义，为胃癌早期诊断和个体化治疗寻找有效分子指标以及奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 2007年5月-2010年12月于苏州市中西医结合医院就诊的胃癌患者89例以及同期健康对照89例，所有入选患者的临床病理资料完整。病例纳入标准如下：①经病理组织学确诊为胃癌，且均为初诊初治患者；②入组患者术前均未接受放、化疗及生物治疗；③入组患者肝肾功能未见明显异常；④未合并其他肿瘤或严重内科疾病。入组患者术前空腹采血5 ml，枸橼酸钠抗凝去酶的采血管中保存。经本院伦理委员会批准，所有入选本课题的胃癌患者均同意使用其外周血标本用于科学研究并签署知情同意书。

1.1.2 实验试剂和仪器 Survivin和CK19引物由上海吉玛科技有限公司合成，血液总RNA试剂盒购自北京天根科技有限公司，RNA逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，SYBR Premix试剂盒购自TaKaRa公司；主要仪器如下：美国Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，Thermo公司 -80℃冰箱，海尔公司-20℃冰箱，德国Eppendorf公司台式低温高速离心机。

1.2 外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的提取及逆转录

外周血总RNA提取方法参照北京天根科技有限公司的血液总RNA提取试剂盒所述步骤。紫外分光仪检测RNA浓度及纯度。逆转录步骤参照TaKaRa逆转录试剂盒所述步骤，每个逆转录体系中含有10 ng的RNA模板。逆转录条件为：30℃ 10 min，42℃50 min，95℃ 5 min，反应产物储存于-20℃冰箱备用。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）条件为：95℃5 min，94℃ 30 s，72℃ 60 s，循环40次，最后72℃5 min， Survivin mRNA复性温度62℃30s，CK19 mRNA复性温度63℃ 30 s。采用相对定量法计算外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的相对表达量（F），F=2-ΔCt，ΔCt=Ct miR-17-5p-CtU6，Ct为每个反应管荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，采用Speraman相关分析，外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者中的诊断价值采用ROC曲线，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，各组间生存差异比较采用Log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin和CK19在胃患者外周血中的表达

RT-PCR结果显示，健康对照中Survivin的表达水平为（1.871±1.317），胃癌患者外周血中Survivin表达水平为（8.131±4.182），经t检验，差异有统计学意义（t=7.195，P=0.019）；健康对照中CK19的表达水平为（1.018±0.819），胃癌患者外周血中CK19表达水平为（13.256±7.518），经t检验，差异有统计学意义（t=12.013，P=0.003）。89例胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达水平均高于健康对照组。见图1。

图1 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达水平

2.2 外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的诊断价值

根据89例胃癌患者和健康对照外周血中Survivin和CK19 mRNA的表达水平分别绘制ROC曲线。结果显示，Survivin的ROC曲线下面积为0.8305（95%CI：0.784，0.887），敏感性为78.151%，特异性为85.394%，对应诊断界值为7.875（图2A）；CK19的ROC曲线下面积为0.8149（95%CI：0.761，0.899），敏感性为73.157%，特异性为81.825%，对应诊断界值为8.114（图2B）。两者联合检测并联试验可提高敏感性至92.136%，串联实验可提高特异性之97.751%，高于任一单一指标的检测，提示外周血中的Survivin mRNA和CK19 mRNA表达水平在胃癌患者中均具有较高的诊断价值。

图2 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的诊断价值

2.3 外周血Survivin mRNA的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系

χ2检验显示，外周血Survivin mRNA的表达与胃癌患者的TNM分期正相关，组间差异有统计学意义（P＜0.05），随着TNM分期的进展，外周血中Survivin mRNA的表达水平亦逐渐升高。而外周血Survivin的表达与患者的年龄、性别、Lauren分型等临床病理特征无相关。见表1。

2.4 外周血CK19 mRNA的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系

χ2检验显示，外周血CK19 mRNA的表达与胃癌患者的TNM分期正相关，组间差异有统计学意义（P＜0.05），随着TNM分期的进展，外周血中CK19 mRNA的表达水平亦逐渐升高。而外周血CK19 mRNA的表达水平与患者的年龄、性别、Lauren分型等临床病理特征无相关。见表2。

2.5 外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA表达水平与胃癌患者术后5年生存率的关系

根据外周血中Survivin mRNA表达水平，将胃癌患者分为Survivin高表达组和Survivin低表达组。Kaplan-Meier生存曲线显示，Survivin高表达组的胃癌患者的术后5年总体生存率低于Survivin低表达组（P＜0.05）。而后，根据外周血中CK19 mRNA表达水平，将胃癌患者分为CK19高表达组和CK19低表达组。Kaplan-Meier生存曲线显示，CK19高表达组的胃癌患者的术后5年总体生存率低于CK19低表达组（P＜0.05）。最后，根据胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达水平，将胃癌患者分为Survivin+CK19+组、Survivin+CK19-组、Survivin-CK19+组和Survivin-CK19-组，利用K-M曲线分析4组胃癌患者术后5年生存率的差异，结果显示，Survivin+CK19+组胃癌患者术后5年生存率低于其他各组，Survivin-CK19-组胃癌患者术后5年生存率高于其他各组（P＜0.05）。见图3。

表1 外周血Survivin mRNA表达水平与89例胃癌患者临床病理因素的关系 例

表2 外周血CK19 mRNA表达水平与89例胃癌患者临床病理因素的关系 例

图3 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和/或CK19 mRNA表达与患者术后5年生存率的关系

3 讨论

循环肿瘤细胞是肿瘤转移和复发的元凶，检测肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞有助于动态监测肿瘤治疗效果及预测预后。Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白，定位于17q25染色体，其特异性地高表达于肿瘤组织，与肿瘤发生及进展密切相关[12]。CK19是国内外应用最广泛的检测上皮来源肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞表达情况的生物标志物[12]。Survivin和CK19是常用的循环肿瘤细胞的鉴定标志物。本研究利用RT-PCR检测了Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血的表达水平，并进一步研究了Survivin mRNA和CK19 mRNA与胃癌患者早期诊断、临床病理特征和术后生存率之间的关系。本研究显示胃癌患者外周血中Survivin mRNA的表达水平高于健康对照组，提示了Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌早期诊断中的潜在价值。因此，利用ROC曲线进一步检测Survivin mRNA和CK19 mRNA的诊断价值，结果显示Survivin mRNA和CK19 mRNA均为胃癌早期诊断的有效分子指标。更为重要的是，联合检测Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血中表达可进一步提高胃癌早期诊断的敏感性或特异性，可避免单一检测带来的假阳性和假阴性等局限性。

研究证实，胃癌患者腹腔灌洗液中Survivin的表达水平与胃癌患者肿瘤浸润深度、淋巴转移和TNM分期密切相关[13]。而关于CK19与胃癌临床病理特征的关系目前尚存在争议。既往研究采用RT-PCR检测胃癌患者外周血中CK19 mRNA在胃癌中的表达及临床意义，发现CK19 mRNA与胃癌患者的年龄、性别和TNM分期等病理特征无相关[14]。另有研究利用免疫荧光法检测CK19在外周血中的表达表达，研究发现外周血中CK19的表达与淋巴结转移、远处转移和复发密切相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期和肿瘤分化程度无关。然而本研究显示Survivin mRNA和CK19 mRNA与胃癌患者的TNM分期呈正相关[15]。各实验结果差异的可能原因为实验方法敏感性和特异性的差异以及不同的病例群。为了进一步明确胃癌患者外周血中CK19与胃癌患者临床病理特征的关系，急需进一步的大病例群前瞻性研究。

既往研究显示，外周血CK19 mRNA阳性的患者术后5年生存率低于CK19 mRNA阴性组[14]，且CK19阳性或Survivin阳性的循环肿瘤细胞与胃癌患者的预后密切相关，是判断胃癌患者预后和复发独立的分子指标[16-17]。值得注意的是，也有研究报道CK19 mRNA的表达水平与胃癌患者预后并无相关[18]。为了进一步明确外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达水平与胃癌患者预后的关系，本研究进一步分析了2者单独和联合检测在胃癌患者预后判断中的价值。本研究结果证实Survivin mRNA和/或CK19 mRNA阳性的胃癌患者术后5年生存率低于Survivin mRNA和/或CK19 mRNA阴性组。更为重要的是，联合分析2者表达与胃癌术后5年生存率的关系显示，Survivin+CK19+组胃癌患者术后5年生存率低于其他各组，Survivin-CK19-组胃癌患者术后5年生存率高于其他各组，提示联合检测2者表达水平更有助于判断胃癌患者预后并制定个体化治疗方案。

综上所述，本研究证实了胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA表达高于健康对照组；外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA均为有效的胃癌早期诊断的分子指标；外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达水平与胃癌的TNM分期呈正相关，而与年龄、性别、及Lauren分型等临床病理特征无相关；Survivin+CK19+组胃癌患者术后5年生存率低于其他各组，Survivin-CK19-组胃癌患者术后5年生存率高于其他各组。本研究为胃癌发生及进展的基础研究奠定了一定的前期基础，为胃癌的早期诊断及个体化治疗提供了潜在的分子靶点。

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