抗菌肽LL-37与膀胱尿路上皮癌关系的初步探讨*

朱波，曾琪，潘广瑞，赵晖

（昆明医科大学第一附属医院 泌尿外科，云南 昆明 650032）

抗菌肽LL-37是人体内固有免疫成员。近来研究表明，其在抗感染、免疫调节、促血管生成、抑癌及促癌等方面均发挥生物学作用[1]。且作为泌尿道重要的天然免疫因子，在从肾盂到膀胱黏膜的上皮中均有表达，并在细菌侵入时迅速合成和分泌，提示其与泌尿系感染密切相关[2]。MICHAUD等[3]发现，慢性炎症可促进膀胱癌的发生。同时也有研究显示膀胱癌会被急性炎症抑制[4]。SUTTMANN等[5]还报道合成抗菌肽天蚕素A、B可抑制膀胱癌的增殖，对良性的纤维母细胞则几乎没有影响。这些发现引导笔者联想到LL-37和膀胱癌间的联系，该实验旨在初步探讨两者的关系，为今后研究奠定基础，以期望为膀胱癌的治疗找到一条新的途径。

1 资料与方法

1.1 实验材料

T24、EJ和SV-HUC-1细胞株均购于中国科学院昆明动物研究所细胞库，LL-37ELISA试剂盒购自荷兰Hycult公司，LL-37由上海吉尔生化有限公司合成，PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，β-actin多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，兔抗人LL-37多克隆抗体由美国Abcam公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方法 膀胱癌T24、EJ细胞培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基，SV-HUC-1细胞则仅将基础培养基更换为DMEM高糖，均置于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱，每2、3天更换培养液，当细胞汇合度达80%～90%时传代。

1.2.2 ELISA法检测尿液、细胞培养液上清中LL-37的水平 2014年1月-2014年6月昆明医科大学第一附属医院膀胱癌患者30例，并随机选取30例健康志愿者，收集他们的新鲜晨尿后照LL-37检测试剂盒说明书对样本进行检测。将3株细胞以1×105个/ml的密度接种于24孔板，300μl/孔，待细胞汇合度达60%时更换无血清培养液，分别加入1、5和10μg/ ml LPS，各设3个副孔及空白对照组，继续培养后照LL-37检测试剂盒说明书对各孔进行测定。

1.2.3 免疫组织化学和RT-PCR检测膀胱癌组织及其周围组织LL-37的表达 2014年1月-2014年9月昆明医科大学第一附属医院膀胱癌患者30例，术中取癌组织标本及其周围1 cm以内的黏膜、肌层组织标本（外观上无明显炎症反应），作为肿瘤组、癌旁组。依据免疫组织化学试剂盒说明书操作，反应后呈棕黄色判定为LL-37阳性。参考文献[6]设计并合成LL-37引物，正向引物：5'-GATA ACAAGAGATTTGCCCTGCTG-3'，反向引物：5'-TTTC TCAGAGCCCAGAAGCCTG-3'，扩增片段大小为173 bp，内参照β-actin正向引物：5'-CCCATCTATG AGGGTTACGC-3'，反向引物：5'-TTTAATGTCACGC ACGATTC-3'，扩增片段大小为150 bp，均由上海华大基因公司合成。采用Trizol法提取组织总RNA。PCR反 应 体 系：模 板 DNA 1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs 4μl、LL-37正 反 向 引 物 各 0.5μl、ddH2O 15μl、TaqDNA 聚 合酶 0.25μl。PCR 反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，共30个循环，72℃继续延伸10 min。反应后对PCR反应液行琼脂糖凝胶电泳以确认RTPCR扩增产物（约173 bp）。若该位置有条带，则用琼脂糖凝胶回收并行克隆和测序。最后照PCR试剂盒说明书行RT-PCR反应，结束后确认RT-PCR的扩增和融解曲线及PCR定量时制作的标准曲线。

1.2.4 MTT检测细胞经LL-37处理的增殖情况将3株细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板，100μl/孔。分别加入22.5、45.0、90.0、180.0和270.0μg/ml LL-37，各设5个副孔及空白对照组。24 h后加入20μl/孔 MTT（5mg/ml），孵育4 h后吸弃孔内培养液，加入150μl/孔 DMSO混匀10 min。酶标仪上测490 nm处吸光度OD值，实验重复3次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）来表示，两独立样本比较用t检验，各组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿液、组织标本及细胞培养液上清中LL-37的表达

2.1.1 膀胱癌患者尿液中LL-37水平 膀胱癌组和健康对照组的LL-37水平分别为（24.32±0.02）和（2.02±0.06）ng/ml，经t检验，差异有统计学意义（t=1 931.240，P=0.000），膀胱癌患者尿液中LL-37水平较健康对照组升高。

2.1.2 各组织中LL-37的表达 LL-37在膀胱癌组织中表达阴性，而在癌组织周围的炎症细胞、血管壁及平滑肌内却呈阳性表达。见图1。

2.1.3 各组织中LL-37的表达 以β-actin的PCR产物条带亮度作为阳性对照，亮度越高提示LL-37表达越高，可见膀胱癌旁组织中LL-37的表达比癌组织相对较高。见图2。

经过RT-PCR得出膀胱癌组织和膀胱癌旁组织中LL-37基因表达的Ct值Ct癌、Ct癌旁，分别与内参β-actin的Ct值Ct内参比较，经过公式2ΔCt=2Ct癌/癌旁-Ct内参计算后可见膀胱癌旁组织中LL-37的表达约是癌组织的30倍。见图3。

2.1.4 细胞培养液上清中LL-37的表达 SVHUC-1、T24、EJ细胞经LPS刺激后细胞培养液上清中LL-37浓度均升高，提示随着LPS浓度增加，3株细胞中LL-37表达升高。见表1。

2.2 体外LL-37作用后细胞的增殖情况

如表2所示，各浓度LL-37的T24、EJ、SVHUC-1细胞的吸光度值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），对T24、EJ细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈一定剂量依赖性，而LL-37在浓度达270μg/ml时才表现出对SV-HUC-1细胞的抑制作用。

图1 各组织中LL-37的表达 （免疫组织化学法×100）

图2 各组织中LL-37的表达

图3 癌及癌旁组织LL-37的相对表达

表1 细胞培养上清液中LL-37的表达（n=4，ng/ml，±s）

表1 细胞培养上清液中LL-37的表达（n=4，ng/ml，±s）

注：† 与 0μg/ml组比较，P＜0.05

组别 SV-HUC-1 T24 EJ 0μg/ml 8.09±0.12 5.32±1.84 7.53±0.12 1μg/ml 9.41±0.67 20.78±2.84† 7.99±0.55 5μg/ml 41.41±3.28† 50.15±4.07† 10.27±0.59†10μg/ml 54.00±2.89† 62.51±0.54† 13.33±0.34†F值 435.308 389.821 144.225 P值 0.000 0.000 0.000

表2 MTT检测细胞的吸光度值比较 （n=6，±s）

表2 MTT检测细胞的吸光度值比较 （n=6，±s）

注：† 与 0.0μg/ml组比较，P＜0.05

T24 EJ SV-HUC-1 0.0μg/ml 0.703±0.0461 0.922±0.0592 0.342±0.0056 22.5μg/ml 0.579±0.0469† 0.773±0.1096† 0.339±0.0096 45.0μg/ml 0.555±0.0229† 0.708±0.0939† 0.336±0.0077 90.0μg/ml 0.541±0.0331† 0.576±0.0485† 0.329±0.0104 180.0μg/ml 0.505±0.0236† 0.413±0.0311† 0.330±0.0061 270.0μg/ml 0.384±0.0239† 0.226±0.0664† 0.289±0.0074†F值 54.720 83.360 35.830 P值 0.000 0.000 0.000组别

3 讨论

近年来研究显示，LL-37与肿瘤的关系很微妙，其可抑制胃癌、结肠癌细胞的增值，又能促进乳腺癌、卵巢癌、肺癌的生长[7]，更值得一提的是LL-37可在同一肿瘤中表现为抗癌和促癌作用。VON等[8]发现，20～30 ng/ml LL-37可促进肺癌细胞的增值，而将其浓度调为20μg/ml后癌细胞的数量明显减少。LI等[9]发现，肿瘤微环境中的免疫细胞分泌的Cathelicidin类抗菌肽可促进结肠癌细胞生长；与REN等[10]的研究结论不同之处也在于其所用的LL-37浓度为生理水平甚至更低，用于人、鼠结肠癌细胞的各为1μg/ml、100 ng/ml，而文献中LL-37的浓度为20～60μmol/l。由此可见LL-37浓度的差异对肿瘤的影响。

该实验中LL-37在膀胱癌患者尿液中的浓度较健康志愿者高，那么这一升高的LL-37来源于何处呢？结合免疫组织化学法结果来看，LL-37主要表达在癌组织周围的平滑肌、炎症细胞及血管壁等处，而在癌组织中表达阴性，提示这一升高的LL-37很可能来自于这些癌旁组织或者说是肿瘤细胞生长微环境中的炎症细胞等分泌。且最近有研究表明，胰腺导管腺癌微环境中的LL-37在胰腺肿瘤干细胞介导的肿瘤发生中起着关键性的作用[11]。也有研究发现，髓细胞表达的鼠同源Cathelicidin抗菌肽CLAMP可通过募集炎症细胞促进肺癌的生长，且肿瘤细胞会分泌可溶性因子诱导巨噬细胞中LL-37的表达，提示LL-37、炎症和肿瘤有着密切的联系[12]。朱小丹等[13]在体外将巨噬细胞和卵巢癌细胞共同培养以构建简化的肿瘤微环境模型时，也发现巨噬细胞可通过增强抗菌肽LL-37的表达和分泌促进卵巢癌细胞的增殖。这些研究提示，肿瘤微环境中LL-37的存在及其对肿瘤的影响。该研究发现，膀胱癌组织的微环境中有明显的LL-37表达，且经LPS刺激后膀胱癌细胞培养液上清中也有其浓度的升高，提示这些浓度范围内的LL-37对膀胱尿路上皮癌是没有害处的。然而，当在体外使用22.5～270μg/ml LL-37时，其可抑制膀胱癌细胞的增殖，而对正常尿路上皮细胞的抑制作用则不明显，表明在一定的浓度范围内LL-37对肿瘤细胞的杀伤作用更大。同时研究表明，多西他赛搭载LL-37后的温敏凝胶颗粒可提高对大肠癌腹膜转移癌的抗癌效果，提示治疗肿瘤时可联合使用LL-37[14]。对于该研究中提示的体内外LL-37的不同作用，笔者认为和前述的LL-37在同一肿瘤中表现为抗癌和促癌一样，是由浓度的差异所引起的。

另外，有学者在探讨LL-37对卵巢癌的作用时，采用基因芯片技术对LL-37在膀胱癌的表达也进行检测，结果显示，1例膀胱癌组织中有明显的LL-37表达，这可能是由于其在采集肿瘤组织标本中的同时也包含了膀胱平滑肌、血管等组织，且只有1例，而与该实验结果有出入[15]。而最新研究结果显示，膀胱癌细胞可通过分泌LL-37来抑制BCG的内化，在加入LL-37抗体后，BCG的抗肿瘤效应又明显增强，提示一定浓度的LL-37可能更适应膀胱肿瘤的生长，这在某些方面上与该研究结论有着相似之处[16]。然而，该研究中关于LL-37和膀胱尿路上皮癌的探讨还仅限于初级阶段，尚需后期进一步实验来阐释两者间复杂的关系。

该研究通过LPS刺激可诱发T24、EJ和SVHUC-1细胞分泌LL-37，表明除了正常尿路上皮细胞，膀胱尿路上皮癌细胞同样可以产生LL-37。同时，笔者还发现膀胱肿瘤细胞微环境中存在着一定浓度的LL-37，提示其可能在肿瘤的发病中起到一定作用，然而是肿瘤细胞促进LL-37的产生，还是LL-37诱导肿瘤的发生，尚需进一步证实。且该研究中仅检测30例膀胱癌患者的肿瘤组织标本，样本数不是很大，但其还是在一定程度上提示LL-37与膀胱尿路上皮癌的相关性。另外，体外高浓度的LL-37可抑制膀胱癌T24、EJ细胞的增殖。

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