星点设计-效应面法优化知母盐制的炮制工艺

王晓婷 闫 丽 孙冬月 王馨雅 高 慧

辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600

知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge）的干燥根茎，始载于《神农本草经》，具有清热泻火、滋阴润燥的功效，用于外感热病，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘等症[1]。盐炙知母最早见于宋代的《扁鹊心书》，盐炙法是历史上知母的主流炮制方法，盐知母为历版《中国药典》收载的知母饮片的唯一炮炙品种。传统理论认为知母盐炙后能够“引药入肾经，增强滋阴降火的作用”[2-4]。

在前期的实验研究中，我们多次证明了知母盐制后降糖效果显著增强[5-7]。知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷均具有降血糖活性，且为炮制后增量，是盐知母降血糖作用增强的物质基础。在盐知母降血糖作用增强未知的情况下，我们以当时2005、2010版《中国药典》知母含量测定项下的菝葜皂苷元、芒果苷含量为指标进行了盐知母炮制工艺的研究[8]。随着研究的深入，降血糖作用物质基础的揭示，有必要以降血糖有效成分为指标对炮制工艺进行优选，并对工艺优化后的盐知母降血糖作用进行再评价，为盐知母饮片的炮制提供规范的工艺参数，为生产质优效确的饮片提供技术支持。

现版《中国药典》盐知母的质量标准中的含量测定项，为测定芒果苷、知母皂苷Ⅱ的含量，其中对盐知母中两种成分含量的规定均低于生知母饮片。我们研究表明知母盐炙后芒果苷、知母皂苷Ⅱ的含量均增加，可见药典中质量标准缺乏真正控制盐知母质量的有效性。另外，知母皂苷Ⅱ是炮制过程的中间产物，在盐炙过程中会进一步水解成降血糖的活性成分知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ，所以将知母皂苷Ⅱ作为含量测定指标亦不够科学。所以本课题以优化后的盐炙工艺自行炮制盐知母样品，以知母炮制后的增量成分知母皂苷A III、知母皂苷B III、芒果苷为含量测定指标[9]，建立盐知母质量评价的含量测定标准。以弥补《中国药典》盐知母饮片含量测定指标的不足，为药典再版时制订针对盐知母质量的真正能有效控制盐知母的质量标准提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器

LC-20AB高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Corona电雾式检测器（美国ESA公司）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；十万分之一分析天平（瑞士METTLER公司）；电子天平（上海精密科学仪仪器有限公司）；Waters高效液相色谱仪（waters e2695、Waters2998PDA、自动进样装置）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 主要材料及试剂

知母饮片购于四川新荷花片饮股份有限公司（1405127），知母药材采自河北省易县西陵镇太和庄、龙泉庄，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为百合科知母属植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.干燥根茎。知母皂苷AⅢ对照品（纯度≥98%，批号MUST-13042609）、知母皂苷BⅢ对照品（纯度≥98%，批号MUST-13121110）均购自成都曼思特生物科技有限公司，芒果苷对照品（纯度≥98%，批号111607-200402）购自中国药品食品生物制品检定所。甲醇、乙腈为色谱纯，娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 知母皂苷类含量测定

2.1.1 色谱条件 Thermo C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）； 流动相为水 -乙腈 ，流速为 1mL/min；进样量：20μL，柱温：30℃，Corona参数：氮气压力35psi（241.3kPa），filter：High，Range：200pA； 梯度洗脱程序见表1。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，测定。对照品、知母样品的色谱分离图见图1。结果表明，保留时间适中，供试品色谱峰的保留时间和峰形与对照品均一致，供试品中知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷B-Ⅲ与其它相邻色谱峰的分离度良好，对照品、供试品的理论塔板数不少于5000。说明该分析条件良好，符合定量分析要求。

2.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷B-Ⅲ对照品适量，甲醇溶解，作为对照品储备液。精密量取各储备液适量，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷B-Ⅲ质量浓度分别为0.273mg/mL，0.265mg/mL的混合对照品溶液。

表1 梯度洗脱条件

图1 知母皂苷类对照品及知母样品HPLC图

2.1.3 供试品溶液制备 取盐知母粉末（过三号筛）1.0g，精密称定，用约8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，合并滤液，得醇浸膏。浸膏以100mL甲醇分散滤过，即得。

2.1.4 方法学考察 （1）线性范围考察：分别精密吸取对照品储备溶液 1、4、8、10mL 置 25mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别进样20μL，以进样浓度为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），分别绘制标准曲线。知母皂苷AIII回 归 方 程 为 Y=282360.784X+1712592，r=0.9997；知母皂苷BIII回归方程为：Y=1995356.06 X-3190777，r=0.9995。结果表明知母皂苷A-Ⅲ在 0.2184～ 2.184μg、知母皂苷 B-Ⅲ在0.212～2.12μg范围内呈良好线性关系。（2）精密度试验：分别精密吸取上述配制的知母皂苷AIII、知母皂苷BIII对照品溶液，连续进样6次，每次均20μL，按前述色谱条件，测定色谱峰面积，结果知母皂苷AIII、知母皂苷BIII峰面积RSD分别为1.69%、1.33%。测定结果表明，仪器精密度良好。（3）稳定性试验：精密吸取同一份供试品溶液，按上述色谱条件分别于 0、2、4、6、8、12、24h 进样 20μL，测定色谱峰面积，结果知母皂苷AIII、知母皂苷BIII的RSD分别为1.53%、1.64%，表明供试品溶液在制备后24h内色谱峰面积无明显变化，稳定性良好。（4）重复性试验：取盐知母样品6份，按供试品项下制备供试品溶液，分别精密吸取20μL按拟定色谱条件进行测定，计算含量。结果样品中知母皂苷AIII、知母皂苷BIII含量的RSD 分别为1.42%和1.22%，表明方法重复性好。（5）加样回收率：精密称定已知知母皂苷AIII、知母皂苷BIII含量的知母饮片6份，每份0.25 g，置50mL量瓶中，分别精密加入知母皂苷AIII对照品溶液（0.273mg/mL）20 mL、知母皂苷BIII对照品溶液（0.265mg/mL）20mL，按供试品制备制成样品，以上述色谱条件进行测定，计算加样回收率，知母皂苷AIII、知母皂苷BIII加样回收率分别为99.98%、99.65%，RSD值为1.2%、0.79%，符合规定。2.1.5 样品含量测定 按上述方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件，每次进样20μL，测定峰面积，采用外标一点法计算知母皂苷AIII、知母皂苷BIII的含量。

2.2 知母中芒果苷含量测定

2.2.1 色谱条件 Ecosil色谱柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相乙腈（A）-0.2% 冰醋酸（B），梯度洗脱（0～ 10min，10%A；10～ 25min，15%A），体积流量1.0mL/min，检测波长258nm，进样量10μL。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，测定。对照品、知母样品的色谱分离见图2。结果表明，保留时间适中，供试品色谱峰的保留时间和峰形与对照品均一致，供试品中芒果苷与其它相邻色谱峰的分离度良好，对照品、供试品的理论塔板数不少于5000。说明该分析条件良好，符合定量分析要求。

图2 芒果苷与知母供试品的色谱图

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取芒果苷对照品适量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得芒果苷质量浓度为0.8065 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取盐知母粉末（过三号筛）0.1g，精密称定，至于25mL具塞锥形瓶中，加稀乙醇约25mL，称重，超声提取（功率40W，频率100Hz）放冷后，补足失重，即得。

2.2.4 方法学考察 （1）线性范围考察：分别精密吸取对照品储备溶液 1、4、8、10mL 置 25mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别进样20μL，以进样浓度为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），分别绘制标准曲线。芒果苷回归方程为：Y=150684X+20288，r=0.9991。结果表明芒果苷在0.6452～6.452μg范围内呈良好线性关系。（2）精密度试验：分别精密吸取上述配制的芒果苷对照品溶液，连续进样6次，每次均20μL，按前述色谱条件，测定色谱峰面积，结果芒果苷峰面积RSD为1.47%。测定结果表明，仪器精密度良好。（3）稳定性试验：精密吸取同一份供试品溶液，按上述色谱条件分别于 0、2、4、6、8、12、24h 进样 20μL，测定色谱峰面积，结果芒果苷的RSD为1.61%，表明供试品溶液在制备后24 h内色谱峰面积无明显变化，稳定性良好。（4）重复性试验：取盐知母样品6份，按供试品项下制备供试品溶液，分别精密吸取20 μL按拟定色谱条件进行测定，计算含量。结果样品中芒果苷含量的RSD为1.42%和1.39%，表明方法重复性好。（5）加样回收率：精密称定已知芒果苷含量的知母饮片6份，每份0.5g，置100mL量瓶中，分别精密加入芒果苷对照品溶液（0.8065mg/mL）10 mL，配制成样品，计算加样回收率为99.82%，RSD值为0.85%，符合规定。

2.2.5 样品含量测定 按上述方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件，每次进样10μL，测定峰面积，采用外标一点法计算芒果苷的含量。

2.3 单因素考察

首先以“药透汤尽”作为加水量、闷润时间的判断标准，确定加水量为30mL/100g、闷润时间以药透汤尽判断，大约2～4h。然后根据经验以加盐量、炒制温度、炒制时间为影响因素，进行单因素考察。

2.3.1 炒制时间的选择 取知母10份，加盐量为3g/100g，闷润吸尽后，以150℃为炒制温度，分别炒制 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18min，以“炒干”这一传统判断标准对不同的炒制时间进行评价，结果表明炒制10～12min时效果最好，“干而不糊”。

2.3.2 炒制温度的选择 取3份知母，加盐量为3g/100g，闷润吸尽后，分别以 120、150、180℃炒制，用盐量为3g，炒制10min，以“炒干”这一传统判断标准对不同的炒制温度进行评价，结果表明150℃效果最好。

表3 实验设计及结果

2.3.3 加盐量的选择 取5份知母，加盐量分别为 1g/100g、2g/100g、3g/100g、4g/100g、5g/100g，在150℃下炒制10min，通过外观对不同用盐量进行评价，各用盐量之间无明显差异。

2.4 星点实验设计与效应面分析[10]

在单因素考察的基础上，采用软件Design-Expert 8.0.7.1中Central Composite试验设计方法，结合经验选取加盐量（A）、炒炙时间（B）、炒炙温度（C）为试验的3个因素，5个水平分别以±1.732，±1，0进行编码，见表2。制备样品，以知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷总含量（mg/g）为效应值（Y）。采用Design-Expert 8.0.7.1软件进行多元回归拟合，判断模型优劣，确定最佳工艺，并进行工艺验证。每次称取100g盐知母，按表2试验，并以HPLC-CAD法测定知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ的含量，以HPLC-PDA法测定芒果苷的含量。

表2 星点设计因素与水平表

3 结果

3.1 实验设计及结果

根据文献报道，在单因素考察基础上，利用星点设计效应面法，对加盐量、炒炙时间、炒炙温度这3个影响显著的考察因素进行优化设计。每个因素设计5个水平，分别用代码值0，-1，1，-0.1732，0.1732表示，结果见表3，知母皂苷B-Ⅲ、知母皂苷A-Ⅲ、芒果苷的总含量为指标，用三因素五水平的星点设计效应面法优化盐知母炮制工艺。结果表明，20组实验所得出知母皂苷B-Ⅲ、知母皂苷A-Ⅲ、芒果苷的差异很大，其中知母皂苷A-Ⅲ的范围是1.091%～3.483%，知母皂苷B-Ⅲ的范围是0.883%～1.942%，芒果苷的范围是0.598～1.024%。

3.2 模型拟合度

由试验结果分析得出，运用Design-Expert.V8.0.6.1软件以总评OD值为因变量，对自变量进行分析，所得回归方程为：Y=0.79-0.020A+0.041B+0.027C-0.047AB+0.06AC+0.00763BC-0.018A2-0.062B2-0.06C2（r=0.9193），相关系数r较大，表明模型具有较高的显著性，可看出方程预测性和拟合度较好，可用此模型对知母盐炙工艺进行预测分析。由方差分析表，可看出B加热温度对总评OD影响较为显著。

3.3 效应面优化与预测性评价

根据回归方程式，运用星点设计的相关软件得到3D图像，再由图3得到最优区域，并筛选出最佳炮制工艺。由图3可以得知，在A、B因素中，随着因素B温度的增加，而曲面变陡峭；而A盐量的影响相对变小。而在A、C因素中，随着A盐量和C炒制时间的增加，曲面走向变得平缓；在B、C方面，随着B温度的增加，OD值也随之增加，而使得曲面变陡，随着C炒制时间的增加，使得OD值得变化变得平缓。由以上的分析可知，B炒制温度对其影响较大，而B、C影响较小。采用软件Design-Expert 8.0.7.1中Central Composite响应面法得到的最佳工艺参数为用盐量3.37g，炒制温度150.06℃，炒制时间为12.07min。根据实验结果，结合生产实际，确定盐知母炮制工艺为：加盐量3.5g/100g、溶解盐用水量为30mL/100g、闷润时间为2～4h，炒制温度为（150±10）℃，炒制时间为12min。并对此工艺进行验证。证明此炮制工艺可行，可用于实际生产。

表4 模型拟合度

4 讨论

星点设计（central composite design，CCD）是一种新型的试验设计方法，是由数学方法和统计学方法结合而产生的，既二者的结合体[11]。尽管效应对因素的真实效应面不可能完全用数学模型表达，但可以用某一数学模型近似进行模拟，依据该模型描绘的效应面进行条件优选，效应面法使用起来直观、方便、效果较好。近几年来，CCD设计效应面法在药学领域的范围内具有非常好的推广应用前景与价值[12-13]。本研究运用星点设计-效应面法，进一步对盐制知母的炮制工艺进行优化，为其在今后的生产中提供更加合理的依据。

图3 各因素对总评OD影响的三维效应面

本研究以盐知母降血糖作用为切入点，进行了知母、盐知母的化学成分含量比较及HPLC-UV、HPLC-CAD指纹图谱比较，对知母炮制前后知母皂苷及芒果苷的含量进行对比时发现，知母盐炙后知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ和知母皂苷AⅢ含量升高，知母皂苷E的含量降低，并对几种皂苷之间的转化做了推测，知母皂苷E为受热发生裂解生成知母皂苷BII，知母皂苷BII再发生脱水反应，生成知母皂苷BIII和知母皂苷A III[14]。对知母中双苯吡酮类成分的研究发现盐炙后新芒果苷、异芒果苷的含量减少，芒果苷的含量增加。分析了新芒果苷、芒果苷在炮制过程中可能发生的转化，即新芒果苷的糖苷基（O-glc）在发生断裂，转化成芒果苷，使芒果苷含量升高[15]。

此次进行工艺优化研究，我们考虑从生产实际出发，单因素考察结合经验，采用星点设计效应面法，以加盐量、炒制时间、炒制温度为影响因素，结合炮制机理，结合活性成分在炮制过程中的变化规律，以知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷含量为考察指标，确定盐知母炮制工艺研究。

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