内镜下制备胃食管反流病动物模型的方法研究

孙贤久 秦先锋 郭少卿 刘思纯 左海军 张 莉

中山大学附属东华医院消化科，广东东莞 523110

胃食管反流（gastroesophageal reflus disease，GERD）主要是指由于各种因素造成十二指肠或胃的内容物返回到食管中进而引发的并发症或症状[1]。临床上GERD主要表现为烧心、恶心和发酸等症状，重者还会导致食管狭窄、出血、糜烂等严重影响患者的生活质量。目前临床上关于GERD的治疗有许多种方法，包括内科治疗（药物治疗）、外科治疗以及微创治疗等。内科治疗通常无法根治，患者需要长期服药，且易复发因此临床上主要用于轻度胃食管反流患者的治疗；外科治疗虽然效果显著，但是对患者创伤较大，易引起各类手术并发症，近年来随着微创技术的不断发展，逐渐被微创治疗所取代。目前关于GERD的内镜治疗是近年来国内外的研究热点，但其安全性及疗效仍需大量的动物实验或临床实验证实[2-3]。而制备合适的胃食管反流并动物模型对于实验研究的准确性至关重要[4-5]。本研究中提出了一种内镜下环形肌切开术制备胃食管反流病动物模型的方法，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取健康6～12月龄的Beagle实验犬12只，其中雌犬和雄犬各6只，体质量10～12kg。速眠新II麻醉药，甲醛溶液，肾上腺素，靛胭脂，多导肠胃功能测定仪，pH动态检测记录仪，光学显微镜。

1.2 方法

采用内镜下环形肌切开术制备胃食管反流病动物模型，具体步骤如下：（1）术前准备：实验犬在术前禁食禁水1d，以0.1～0.15mg/kg的速眠新II号对实验犬进行静脉全麻，无需进行气管插管，使所有实验犬可以进行自主呼吸，若实验犬在麻醉后仍然存在躁动等状态，应适当增加麻醉药的使用剂量。在内镜下测量门齿到贲门之间的距离，在胃和食管交界处的上端7～10cm处切开黏膜层，并在右后壁黏膜处注射肾上腺素和靛胭脂，采用Hook刀将黏膜层切开1～3cm的开口，暴露黏膜的下层组织，并进行相关的分离操作。（2）食管黏膜下隧道的建立：食管黏膜下隧道建立的核心原则是与食管环形肌层保持垂直的角度，确保黏膜隧道始终处于直线型。（3）切开环形肌：在胃镜下采用Hook刀在GEJ上端7～9cm处切入，从上到下垂直切至GEJ下段1～3cm处，暴露纵行肌，再采用Hook刀从环形肌和纵行肌的空隙中伸入，切入环形肌，在胃镜的引导下，逐步将整个环形肌切开。

1.3 指标测定方法

1.3.1 食管压力测定 于制备前7d和后7d分别采用多导肠胃功能测定仪测定实验犬的食管压力。具体测定方法如下：采用多导胃肠功能测定仪，使用高分辨四道毛细灌注测压系统，以实验犬胃内正常的压力作为基准线，测定其食管压力。

1.3.2 食管pH测定 于制备前7d和后7d分别采用pH动态检测记录仪检测实验犬食管pH值。采集实验犬食管酸反流（pH值＜4）次数，长时间酸反流（pH＜4持续5min以上）次数，最长反流时间（pH＜4持续的最长时间）以及酸反流率。

1.3.3 病理学检查 将实验犬处死，取其食管组织，用甲醛溶液固定，再用石蜡进行包埋，经苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察其食管组织变化情况。

1.4 统计学处理

采用Epidata 3.0对本研究数据进行录入校对，采用统计学软件SPSS19.0版对数据进行统计分析，计量资料采用（x±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验犬结果

12只行内镜下环形肌切开术的实验犬，无死亡，全部存活，其中有8只术后出现反流，另外4只术后未出现反流，采用内镜下环形肌切开术制备胃食管反流病动物模型的成功率为66.7%。

2.2 食管压力情况

制备前后实验犬食管压力情况如下表1所示，制备前实验犬食管压力明显大于制备后，差异有统计学意义（t=4.112，P ＜ 0.05）。

表1 制备前后实验犬食管压力情况比较（x ± s，kPa）

2.3 食管pH情况

制备前后实验犬食管pH情况如下表2所示，制备后的实验犬反流次数、反流最长时间和反流率均大于制备前，差异均有统计学意义（t=3.968，4.037，4.006，P ＜ 0.05），但反流＞ 5min的次数制备前与制备后差异无统计学意义（t=1.651，P＞0.05）。

2.4 病理学检查情况

从病理学检查情况来看，制备前的正常实验犬食管组织呈现明显的复层鳞状结构，上皮层内有少量炎症细胞存在，其他各层均正常。而制备后的实验犬的食管组织中上皮层存在明显的膨胀和增厚，黏膜层有大量的炎症细胞存在，此外部分肌层还存在断裂等情况。

表2 制备前后实验犬食管pH情况比较（x ± s）

3 讨论

从国内外研究报道来看，目前制备胃食管反流病动物模型的方法可以分为两类，即手术法和非手术法，其中手术法又可分为破坏食管下括约肌法、十二指肠或幽门结扎法、空肠或十二指肠吻合术法[6-10]。空肠或十二指肠吻合术法由于完全改变了实验动物的消化道解剖结构，因此通常不能用于疗效评价试验，因此应用相对较少[11]；十二指肠或幽门结扎法制备的食管反流病动物模型通常存活期较短，多用于短期动物实验研究，但无法满足中长期动物实验研究需求[12]；破坏食管下括约肌法虽然对实验动物的造成的创伤较大，实验动物具有较高的死亡率，但是其建模成功率较高，是目前应用最广泛的制备胃食管反流病动物模型的方法[13]。非手术方法主要是指通过食管关注胃蛋白酶或酸制备简单的食管反流模型，但该法制备的食管反流模型通常仅适用于食管黏膜的损害、防御机制研究[14-15]。

本研究中提出了一种内镜下环形肌切开术制备胃食管反流病动物模型的方法，为了探讨内镜下环形肌切开术制备胃食管反流病动物模型的可行性，本研究选取了健康6～12月龄的Beagle实验犬12只进行研究，结果表明12只行内镜下环形肌切开术的实验犬，无死亡，全部存活，其中有8只术后出现反流，另外4只术后未出现反流，建模成功率为66.7%。备前实验犬食管压力明显大于制备后，差异有统计学意义（t=4.112，P＜0.05）。制备后的实验犬反流次数、反流最长时间和反流率均大于制备前，差异均有统计学意义（t=3.968，4.037，4.006，P＜0.05），但反流＞5min的次数制备前与制备后差异无统计学意义（t=1.651，P＞0.05）。从病理学检查情况来看，制备前的正常实验犬食管组织呈现明显的复层鳞状结构，上皮层内有少量炎症细胞存在，其他各层均正常。而制备后的实验犬的食管组织中上皮层存在明显的膨胀和增厚，黏膜层有大量的炎症细胞存在，此外部分肌层还存在断裂等情况。

总而言之，内镜下环形肌切开术是一种简单可靠的制备胃食管反流病动物模型的方法，该法制备胃食管反流病动物模型具有成功率高，不影响实验动物解剖结构，与胃食管反流发病机制吻合等特点，可用于评价胃食管反流的内镜治疗或手术治疗的疗效观察，值得进行推广应用。

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