载脂蛋白E对脾脏淋巴细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响

范丽君, 卢文玉, 唐玉兰, 黄 帆, 李一锋, 卢珍梅, 韦俊杰, 郑明华

中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病如多发性硬化(multiple sclerosis,MS)等疾病的致病机制之一是血脑屏障(blood brain barrier,BBB)完整性受到破坏,在其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中已证实是由CD4+T淋巴细胞透过BBB渗入中枢神经系统(central nervous system,CNS)实质介导的自身免疫性炎症反应所致[1]。

载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)在CNS炎症相关疾病过程中参与BBB通透性的调节,ApoE基因敲除小鼠CNS炎症因子增加且与BBB通透性改变有关。我们已发现,ApoE的缺乏会上调炎症因子的表达,ApoE拟肽可以抑制该效应,从而减少BBB的破坏[2]。而淋巴细胞分泌的TNF-α等炎症因子可以调控基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达[3],进而影响BBB渗透性。因此,我们推测,ApoE可能影响外周淋巴细胞等免疫细胞的炎症因子的分泌,并调节MMP-9的表达,最终影响BBB渗透性。目前诸多研究均集中在动物实验中进行,在体外细胞层面的相关研究少有报道。

已证实EAE小鼠外周免疫激活先于中枢的病理学改变[4],因此,我们通过免疫原启动小鼠外周免疫过程,在体外单独研究ApoE对脾脏淋巴细胞分泌炎症因子及MMP-9的影响,这也更好的排除了神经胶质细胞发挥的中枢固有免疫炎症作用的干扰,以便更深入了解ApoE在CNS炎症相关疾病中对BBB影响的病理机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠,体重17～20 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证号SCXK(京)2009-0004],饲养于广西医科大学实验动物中心的SPF级动物房。

1.1.2 实验试剂 MOG35- 55(序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)购于上海生工生物工程有限公司,纯度>95%。百日咳毒素(PTX)和完全弗氏佐剂(CFA)购于美国Sigma公司；热灭活结核菌素(H37Ra)购于美国BD公司；小鼠TNF-α、IL-17、MMP-9、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。胎牛血清、RPMI-1640培养基、青霉素/链霉素(双抗)购自美国Gibco公司；D-Hanks液购自武汉博士德生物公司；台盼蓝、红细胞裂解液购自索莱宝科技公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫诱导 用0.01 mol/L的PBS缓冲溶液将少突胶质细胞糖蛋白(MOG35- 55)稀释至2 mg/ml,与等量的含4 mg/ml热灭活结核菌素(H37Ra)的完全弗氏佐剂充分混匀,在冰上使用全玻璃注射器抽打制备油包水乳剂抗原。在小鼠背部皮下多点注射MOG35-55乳剂抗原(0.2 ml/只)。免疫当天、免疫后48 h给每只小鼠腹腔各注射一次百日咳毒素200 ng。

1.2.2 脾脏淋巴细胞分离培养(参考Ping Kuang[5]等方法)及干预 免疫后第7天颈椎脱臼法处死小鼠,75%酒精消毒后,无菌条件下分别取ApoE-/-小鼠及WT小鼠脾脏,充分剔除筋膜及脂肪组织,予以无菌D-Hanks清洗两遍,超净台内置于200目筛网,用5 ml注射器针芯轻轻均匀研磨,用适量无菌D-Hanks冲洗过滤,取滤液至15 ml离心管,1000 rpm/min离心5 min洗涤两次,去上清,加入红细胞裂解液(10 ml/只)于冰上裂解10 min除去红细胞,1000 rpm/min离心5 min洗涤两次,去上清,加入含胎牛血清和双抗的RPMI-1640完全培养基轻轻均匀吹打制备细胞悬液接种于T25培养瓶,于5%CO2、37 ℃培养箱净置24 h,以除去贴壁的巨噬细胞,收集未贴壁的细胞悬液即得到脾脏淋巴细胞。用台盼蓝染色,活细胞数大于95%后调整密度为1×106/ml备用。随机分为4组,即ApoE-/- 实验组(E-ApoE-/-)、WT实验组(E-WT)、ApoE-/-对照组(C-ApoE-/-)、WT对照组(C-WT)。两实验组(E-ApoE-/-、E-WT)给予浓度为25 μg/ml的MOG35-55刺激淋巴细胞,两对照组(C-ApoE-/-、C-WT)细胞给予等量生理盐水作为对照处理,24 h后离心收集上清液。

1.2.3 炎症因子及基质金属蛋白酶检测 取各组细胞上一步中收集的上清液各100 μl微升分别加入到TNF-α、IL-17、MMP-9、TIMP-1 ELISA试剂盒,测定各组淋巴细胞TNF-α、IL-17、MMP-9、TIMP-1的浓度,分析各组的表达差异。

2 结 果

2.1 各组脾脏淋巴细胞TNF-α、IL-17表达情况比较 与C-WT组比较,C-ApoE-/-组淋巴细胞TNF-α、IL-17的浓度升高,差异有统计学意义(P<0.05)；分别与对照组相比,E-ApoE-/-组和E-WT组淋巴细胞TNF-α、IL-17浓度均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与E-WT组相比,E-ApoE-/-组TNF-α、IL-17的浓度明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)(见图1A、B)。

2.2 各组脾脏淋巴细胞MMP-9表达情况比较 C-ApoE-/-组淋巴细胞MMP-9的浓度较C-WT组的浓度升高,差异有统计学意义(P<0.05)；E-ApoE-/-组和E-WT组淋巴细胞MMP-9浓度分别与对照组相比,其浓度均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与E-WT组相比,E-ApoE-/-组MMP-9浓度明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

2.3 各组脾脏淋巴细胞TIMP-1表达情况比较 经两两比较,各组小鼠淋巴细胞TIMP-1浓度未见明显差异,差异无统计学意义(P>0.05)(见图3)。

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；TNF-α：肿瘤坏死因子-alpha；IL-17：白细胞介素-17

与E-WT组相比*P<0.05；与C-ApoE-/-组相比!P<0.05；与C-WT组相比#P<0.05

图1 各组脾脏淋巴细胞培养液TNF-α(图1A)、IL-17(图1B)浓度的比较

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；MMP-9：matrix metalloproteinase-9

与E-WT组相比*P<0.05；与C-ApoE-/-组相比!P<0.05；与C-WT组相比#P<0.05

图2 各组脾脏淋巴细胞培养液MMP-9浓度的比较

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；TIMP-1：tissueinhibitor of metalloproteinases 1

E-ApoE-/-组、E-WT组、C-ApoE-/-组、C-WT组脾脏淋巴细胞分泌TIMP-1的浓度未见明显改变(P>0.05)

图3 各组脾脏淋巴细胞培养液TIMP-1浓度的比较

3 讨 论

ApoE是CNS中主要的载脂蛋白,在中枢内具有转运脂质、神经营养、调节炎症、调节免疫等多重生物学作用。动物研究已证实ApoE可以保护EAE小鼠的血脑屏障[6,7]。本研究发现,免疫诱导小鼠后,ApoE-/-小鼠和WT小鼠脾脏淋巴细胞均能分泌炎症因子TNF-α、IL-17；体外用MOG35-55刺激脾脏淋巴细胞后,E-ApoE-/-和E-WT组淋巴细胞炎症因子浓度均升高,且E-ApoE-/-组较E-WT组炎症因子浓度更高,这些说明,单独刺激脾脏淋巴细胞导致炎症因子分泌增加,这可能是发生促炎症反应过程的关键,并且ApoE的缺乏可以加重炎症反应过程,放大炎症级联效应。这可能从两方面来解释：一方面,ApoE拟肽抑制CD4+T淋巴细胞的增殖[8]。由于缺乏ApoE使其对淋巴细胞增殖的抑制作用解除或减弱,因而ApoE-/-小鼠淋巴细胞大量增殖后炎症因子表达增加更明显。另一方面,ApoE-/-小鼠外周淋巴细胞亚群Th1(主要分泌TNF、IFN-γ)、Th17(主要分泌IL-17、IL-22)分化的比例较其他亚群明显增加[2,9,10]并介导EAE等炎性脱髓鞘疾病过程[11]。因此,ApoE-/-小鼠的Th1/Th17淋巴细胞亚群比例增加最终亦导致其炎症因子分泌增加较为明显,进一步加重炎症反应,从而放大炎症级联效应并破坏中枢实质。最近一项动物实验发现,ApoE拟肽显著抑制MMP-9的炎症激活因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β等),从而降低对BBB的降解[12]。另外,在体外BBB模型实验中,予以TNF-α刺激5 h后BBB渗透性即明显增加,且Rho/Rho激酶信号通路参与TNF-α诱导的BBB通透性的调节[13]。与动物实验研究相比,本实验在体外单独对脾脏淋巴细胞研究发现,ApoE可以减少脾脏淋巴细胞炎症因子分泌而调节炎症反应,再结合诸研究结果,该过程可能通过调节炎症因子TNF-α、IL-17等相关的Rho/Rho激酶信号通路来调控MMP-9,最终影响BBB渗透性。

基质金属蛋白酶(MMPs)是BBB破坏的启动因素,其中MMP-9是分解BBB重要基质成分的关键因素。本研究发现,免疫诱导小鼠后,ApoE-/-小鼠和WT小鼠的淋巴细胞均能分泌MMP-9,且ApoE-/-小鼠较明显；MOG35-55在体外刺激脾脏淋巴细胞后,E-ApoE-/-组、E-WT组淋巴细胞MMP-9浓度均明显高于对照组,且E-ApoE-/-组MMP-9浓度较E-WT组更高。说明刺激淋巴细胞可以分泌MMP-9,这将导致BBB基质成分被分解而使BBB完整性破坏,且ApoE的缺乏将导致淋巴细胞MMP-9分泌增加而使BBB破坏更加严重。虽然在小鼠体内已证实缺乏ApoE导致EAE小鼠MMP-9的表达及活性增加[7]，使BBB破坏,但细胞层面的机制尚未明了。我们通过体外淋巴细胞的研究发现,ApoE可能抑制了EAE的淋巴细胞MMP-9的分泌,从而发挥保护BBB的作用。目前已经发现,EAE和MS疾病中TNF-α、IL-1β、IL-17等炎症因子可以诱导MMP-9的表达；炎症因子主要通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)通路来对MMP-9进行调控[3]。最近一项研究还发现ApoE异构体ApoE4可能会增加NF-κB/MMP-9通路的激活,加剧BBB破坏[14]。因此推测,ApoE可能也通过炎症因子TNF-α、IL-17相关的MAPKs、NF-κB通路来调节MMP-9的表达,从而影响BBB。

TIMP-1结合活化态MMP-9并抑制后者的活性,MMP-9/TIMP-1二者结合与BBB完整性密切相关,但TIMP-1在MS表现为小幅度地减少或者无变化[15],因此,当TIMP-1无明显变化时,升高的MMP-9将发挥破坏BBB的作用[16]。我们在体外刺激脾脏淋巴细胞并未发现各组TIMP-1浓度变化的差异,说明了ApoE可能不影响TIMP-1的表达或影响幅度很小,而最终这些升高的MMP-9由于未能被足够的TIMP-1结合而分解BBB基质使其结构破坏。我们的体外细胞实验与小鼠的TIMP-1浓度无明显改变的实验结果[7,17]是一致的。

目前,神经胶质细胞介导的中枢固有免疫性炎症反应对BBB的影响以及ApoE参与其中的调节作用已逐渐被报道[17～19],而与诸多研究不同的是,我们通过敲除小鼠ApoE基因,并在体外排除了动物实验中关于中枢固有免疫细胞(主要是胶质细胞)的炎症损伤作用的影响,独立探索了ApoE对脾脏淋巴细胞的影响,这对阐明ApoE通过调节外周免疫性炎症因子及MMP-9对BBB产生影响是有重要意义的。尽管如此,但我们也还需要进一步在体外的独立环境中对淋巴细胞亚群在这方面的作用进行探究,尤其是体外细胞研究层面探究Th1/Th17亚型的具体作用情况。

通过我们在体外单独对淋巴细胞的研究表明,ApoE可以调节EAE抗原刺激的脾脏淋巴细胞分泌炎症因子TNF-α、IL-17和基质金属蛋白酶MMP-9。再结合相关研究报道,ApoE可能通过影响炎症因子TNF-α、IL-17相关的MAPK、NF-κB、Rho/Rho激酶信号通路等多条途径来调节MMP-9的表达,进而影响BBB的完整性。但是,其涉及的具体作用仍不完全明确,因此还亟待进一步探究,以期发现ApoE在CNS自身免疫性炎症疾病中对BBB影响的确切机制。

[1]Engelhardt B.The blood-central nervous system barriers actively control immune cell entry into the central nervous system[J].Current Pharmaceutical Design,2008,14(16):1555-1565.

[2]Wei J,Zheng M,Liang P,et al.Apolipoprotein E and its mimetic peptide suppress Th1 and Th17 responses in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Neurobiology of Disease,2013,56:59-65.

[3]Daneman R,Prat A.The blood-brain barrier[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,2015,7(1):a020412.

[4]Alvarez JI,Saint-Laurent O,Godschalk A,et al.Focal disturbances in the blood-brain barrier are associated with formation of neuroinflammatory lesions[J].Neurobiology of Disease,2015,74:14-24.

[5]Kuang P,Deng H,Cui H,et al.Suppressive effects of sodium fluoride on cultured splenic lymphocyte proliferation in mice[J].Oncotarget,2016,7(38):61905-61915.

[6]韦俊杰,郑明华,杨程程,等.载脂蛋白E拟肽对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的影响[J].临床神经病学杂志,2016,29(2):124-127.

[7]Zheng M,Wei J,Tang Y,et al.ApoE-deficient promotes blood-brain barrier disruption in experimental autoimmune encephalomyelitis via alteration of MMP-9[J].Journal of Molecular Neuroscience:MN,2014,54(2):282-290.

[8]郑明华,唐玉兰,韦俊杰,等.载脂蛋白E拟肽对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脑脊髓CD4+、CD8+T淋巴细胞表达的影响[J].临床神经病学杂志,2013,26(3):198-201.

[9]Raphael I,Nalawade S,Eagar TN,et al.T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases[J].Cytokine,2015,74(1):5-17.

[10]Legroux L,Arbour N.Multiple sclerosis and T lymphocytes:An entangled story[J].Journal of Neuroimmune Pharmacology:the Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology,2015,10(4):528-546.

[11]Lopes Pinheiro MA,Kooij G,Mizee MR,et al.Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke[J].Biochim Biophys Acta,2016,1862(3):461-471.

[12]Pang J,Chen Y,Kuai L,et al.Inhibition of blood-brain barrier disruption by an apolipoprotein E-mimetic peptide ameliorates early brain Injury in experimental subarachnoid hemorrhage[J].Translational Stroke Research,2017,8(3):257-272.

[13]彭 镜,尹 飞,曾卫民,等.肿瘤坏死因子α对体外血脑屏障模型通透性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(36):7286-7289.

[14]Teng Z,Guo Z,Zhong J,et al.ApoE influences the blood-brain barrier through the NF-kappaB/MMP-9 pathway after traumatic brain injury[J].Scientific Reports,2017,7(1):6649.

[15]Romi F,Helgeland G,Gilhus NE.Serum levels of matrix metalloproteinases:implications in clinical neurology[J].European Neurology,2012,67(2):121-128.

[16]周 瑜,曾艳平,周 琴,等.MMP-9在单纯疱疹病毒性脑炎中的表达及对血脑屏障的影响[J].中风与神经疾病杂志,2015,32(10):902-905.

[17]卢文玉,唐玉兰,李一锋,等.载脂蛋白E对星形胶质细胞基质金属蛋白酶-9表达的作用及机制研究[J].中华神经医学杂志,2017,16(4):349-354.

[18]Broux B,Gowing E,Prat A.Glial regulation of the blood-brain barrier in health and disease[J].Seminars in Immunopathology,2015,37(6):577-590.

[19]Cheslow L,Alvarez JI.Glial-endothelial crosstalk regulates blood-brain barrier function[J].Current Opinion in Pharmacology,2016,26:39-46.